线粒体在细胞凋亡中的作用*

王佺荃 张文丽 元小冬 彭伟 骆泓洁

诸多因素可诱导线粒体通路介导的细胞凋亡，如：DNA的损伤、脱离了原来的生长环境、与细胞生存息息相关的生长因子或激素的缺乏等。在线粒体通路介导的细胞凋亡过程中，主要的反应是cyt-c的释放、电子传递的变化、Bcl家族蛋白的变化以及线粒体膜的改变。

1 细胞凋亡的简介

细胞凋亡是指机体在生理以及病理条件下，为了维持自身内环境的稳态，通过调控基因而使细胞产生的主动、有序的死亡过程，可产生一系列形态和生化方面的特征，包括染色体固缩、核碎裂、凋亡小体形成、细胞皱缩等。细胞凋亡是细胞正常的死亡过程，涉及一系列基因的激活、表达及调控等，但不会造成炎症和细胞自身的损伤，是细胞为了更好地适应其内外环境而自发引起的死亡过程。这一死亡过程因为严格受到程序的调控，所以又被称为细胞程序性死亡，其在维持机体正常生理平衡和清除机体衰老细胞等方面以及多种疾病中都起着重要的作用[1]。

蛋白裂解系统是细胞凋亡的中心环节，包括半胱氨酰蛋白酶家族，被称为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶[2]。细胞凋亡包括两种途径，即Caspase依赖性和非Caspase依赖性细胞凋亡。Caspases分为两类：一类是上游启动者（initiators） Caspases，如Caspases-8、9等，它们可以裂解并激活其他Caspases；另一类是下游效应者（effectors）Caspases，主要包括Caspase-3、6、7，它们可以裂解各种底物，并分解细胞结构或使酶失活。而Caspase-3作为“刽子手”蛋白酶，在凋亡过程中起着关键性的作用。

2 Cyt-c在线粒体凋亡途径中的作用

国内外研究学者发现，凋亡的线粒体途径中最重要的就是线粒体结构和功能的重构导致一系列凋亡蛋白从线粒体内释放到细胞浆，这些蛋白包括cyt-c、Smac/DIABLO、AIF等。在这个过程中，线粒体起着传递和放大死亡信号的重要作用， 是凋亡的上游途径和Caspase 途径以及其他下游死亡途径互相作用的中心环节。cyt-c是线粒体呼吸链中传递电子的载体，电子在转运的过程中，伴随着质子从细胞质被泵到线粒体膜间隙，建立了线粒体的跨膜电位。当质子从线粒体膜间隙返流回细胞质中，使另一个蛋白复合体FOFl-ATP酶产生ATP。所有这些过程都严格有序的进行，如果cyt-c缺失或者功能障碍，将会导致线粒体呼吸链的功能出现异常，进而ATP的生成受阻，导致细胞能量缺乏而死亡。

正常情况下，cyt-c存在于线粒体内膜和外膜之间的腔隙内，细胞凋亡信号的刺激使其从线粒体内释放到细胞质。目前对cyt-c如何从线粒体进入胞浆的机理尚无确切定论，有3种可能性：（1）借助线粒体膜通透性转运孔（Mitochondria permeability transition pore， MPTP）被释放到胞浆[3]；（2）线粒体外膜存在cyt-c的特定通道，待信号刺激时会开放[4]；（3）由于K+的堆积，引起线粒体的肿胀甚至外膜破裂，以致cyt-c被释放[5]。在细胞凋亡过程中，cyt-c一旦释放，可引起两种反应过程，一是由于cyt-c释放到胞质中，线粒体内的cyt-c减少、缺失，可直接引起呼吸链电子传递过程中断，最后导致细胞的坏死，线粒体外膜通透性增高才使cyt-c通过外膜而释放到胞质。二是cyt-c可与细胞内的一种凋亡细胞蛋白酶激活因子结合，通过半胱氨酸蛋白酶募集域的作用，与Caspase-9酶原和Apaf1形成cyt-c/Apaf-1/Caspase-9复合物即凋亡体，活化的 Caspase-9能激活下游的Caspases例如Caspase-3等，从而启动细胞凋亡[6]。Caspase-3家族在细胞凋亡机制中居中心地位，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，一旦被激活，即引起下游一系列的级联反应，使细胞凋亡不可避免，因此，Caspase-3被称为“凋亡蛋白酶”。Luetjens等实验发现，活化的Caspase自身便可作用于线粒体并刺激其释放cyt-c，主要原因是活化的Caspase可以改变线粒体外膜的通透性，干扰电子传递链在线粒体膜上的运输，导致膜电位的变化，进而释放促凋亡因子。

3 Bcl-2家族蛋白简介及作用

3.1 Bcl-2家族蛋白简介 Bcl-2家族蛋白由许多成员组成。根据蛋白的结构和功能不同，可分为3个亚家族：（1）Bcl-2亚家族，对细胞凋亡起抑制作用，成员有Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W和Mcl-1等；（2）Bax 亚家族，对细胞凋亡有促进作用，成员有Bax、Bak、Bok；（3）Bcl-2同源结构域（ Bcl-2 homology，BH）3亚家族，对细胞凋亡也起到促进作用，成员有Bik、Blk、Bad和Bid等[7]。细胞在正常情况下，促进和抑制凋亡的两种蛋白表达量处于相对稳定的状态，当凋亡信号作用于细胞时，促凋亡蛋白表达量会增多，因此促凋亡与抑制凋亡蛋白之间的平衡被打破，细胞就会走向凋亡。

在细胞凋亡中，Bcl-2家族蛋白成员起着重要作用，它们相互作调控细胞凋亡。Bcl-2家族成员彼此可相互形成同源二聚体或异源二聚体，从而调节细胞死亡和存活信号的平衡，是细胞存亡的关键因素。在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族蛋白可调节线粒体通路。Bcl-2和Bcl-xL主要在线粒体的外膜发挥作用，维持膜的完整性，是主要的抗凋亡蛋白；Bax 和Bak可破坏线粒体膜的完整性，促进cyt-c的释放而介导凋亡，是主要的促凋亡蛋白。研究表明，BH3蛋白均具有促进凋亡的作用，当刺激细胞凋亡的因素存在时，BH3的表达会增多，并与Bcl-2和Bcl-xL相结合，使其对抗Bax 和Bak等促凋亡蛋白的作用减弱，促使凋亡发生。

3.2 Bcl-2家族蛋白在线粒体凋亡途径中的作用 Bcl-2家族蛋白通过线粒体途径对细胞凋亡产生影响，具体机制主要有两种： 一是Bcl-2家族蛋白可诱导线粒体通透性转变孔道开放，通透性转变通道是由线粒体的一些内、外膜蛋白组成的，定位于内外膜接触点。当孔道开放，胞浆和线粒体基质内的离子便可以动态流动，造成线粒体基质的高渗状态，线粒体发生膨胀、外膜破裂，从而使膜间隙中的促凋亡蛋白如cyt-c等被释放到细胞质中；若未损伤线粒体外膜，膜间隙中的cyt-c、DIABLO、Smac、凋亡诱导因子和核酸内切酶G等也会被释放到胞质。二是Bcl-2家族蛋白能精确地改变线粒体膜的通透性，它们插入生物膜中，形成离子通道[8]。

研究发现，Bcl-2家族蛋白对cyt-c的释放起着调控作用[9]。Bcl-2和Bcl-xl均能抑制cyt-c的释放，使cyt-c达不到激活下游Caspases的临界值，从而保护细胞不走向凋亡。而Bax、Bak、Bik、和Bid等可在凋亡因子作用下激活并易位到线粒体膜上，破坏线粒体的结构和功能，促使cyt-c释放。由于Bcl-2家族中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白形成孔道的性质不同，这使它们对cyt-c的调控作用也不同[10-12]。

4 线粒体膜的变化

4.1 线粒体膜电位降低 线粒体膜电位是由线粒体内膜两侧的质子和其他离子不对称分布产生的，可保持线粒体的功能。研究发现，在体外培养细胞过程中，线粒体膜电位低的细胞，即使去掉凋亡诱导因素，细胞也会走向凋亡，说明线粒体膜电位降低是细胞凋亡的特征性标志[13]。

线粒体跨膜电位改变与Bcl-2有关。Bcl-2、Bclxl、Bax等在脂质双分子层中能形成孔道[14]；此外，Bcl-2家族蛋白还能与其他孔蛋白相互作用，在线粒体膜上形成一个无选择性的、高运输性的、跨线粒体内外膜的通道PTP（permeability transition pore），PTP可以使大量Ca2+流入胞质中，打破了胞质和线粒体基质间的化学平衡，使线粒体内膜膨胀，进而引起更多PTP开放，最终导致线粒体内膜破裂，致使cyt-c、AIF、胱冬肽酶原释放到胞液中。

4.2 线粒体膜通透性改变（Mitochondrial permeability transition， MPT） MPT会使呼吸链与氧化磷酸化失偶联， 终止了ATP的合成，线粒体基质内的Ca2+外流，还原性谷胱甘肽和NAD（P）H2减少，最终导致细胞走向凋亡。

5 线粒体通路介导的细胞凋亡相关疾病

近期研究表明，临床诸多疾病的发生和发展均与细胞凋亡相关，而线粒体途径引起的凋亡又是细胞凋亡原因的重要组成部分，cyt-c的释放介导线粒体凋亡途径的发生，从线粒体释放到细胞浆中的cyt-c是线粒体介导凋亡信号转导通路中最重要的事件[15-18]。因此，在今后研究中可以通过作用于线粒体引起的细胞凋亡途径中cyt-c的作用靶点，从而延缓或者阻断细胞凋亡的时间来影响相关疾病的进展。

研究发现，在帕金森病患者黑质神经元中检测到神经元内线粒体的衰退和COX活性的降低[19]。线粒体脑病和肌萎缩性侧索硬化等患者的脑区域中也检测到脑组织伴有COX的缺失[20-21]。王冠等[22]研究显示，大鼠脑I/R后4 h模型组，缺血侧脑组织 cyt-c、Caspase-3已开始表达，随再灌注时间的延长而逐渐增加，并在24 h达到高峰，之后便逐渐下降。Xing等[23]Western结果检测到大脑半球缺血区神经元细胞质中cyt-c的表达明显增高，而在线粒体内明显降低。有研究发现脑组织缺血5 min再灌注模型中，当缺血再灌注达24、48 h之后，Western结果检测到海马CA1区海马神经元细胞质cyt-c的量显著增加[23]。

6 结语

综上所述，线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。Bcl-2家族蛋白和Cyt-c在线粒体凋亡途径中的相互影响密切，但Cyt-c在细胞凋亡中的作用和Bcl-2家族蛋白的关系，以及释放机制有待更深层次的研究。鉴于细胞凋亡在许多疾病的发生、发展过程中都扮演重要角色，依据Cyt-c在细胞凋亡过程中的作用途径以及Bcl-2家族的作用部位，可以通过阻断它们作用的某一环节，从而终止细胞凋亡的进行，为疾病治疗开拓新方向。

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