芪参清幽胶囊微生物限度检查方法验证

刘元昆张立贤

（1威海市中医院，山东威海264200；2威海市经区医院）

芪参清幽胶囊微生物限度检查方法验证

刘元昆1张立贤2

（1威海市中医院，山东威海264200；2威海市经区医院）

目的：建立芪参清幽胶囊微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》（2010年版）的规定，进行该品种微生物限度检查方法的验证。结果：常规法试验芪参清幽胶囊对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抗菌作用，回收率小于70%；培养基稀释法可消除本品对上述2种菌株的抗菌作用，回收率大于70%；常规法试验能检出大肠埃希菌。结论：本品可用常规法进行霉菌和酵母菌数测定；可用培养基稀释法进行细菌测定；可用常规法进行控制检验。

芪参清幽胶囊；微生物限度；方法验证

芪参清幽胶囊由黄芪、丹参、白花蛇舌草、蒲公英等11味中药材组成，具有理气和胃、消瘀止痛之功效。适用于湿热淤滞证的慢性胃炎（Hp＋），症见胃脘疼痛、痞满腹胀、喛气返酸等。为保证药品质量，按照《中国药典》（2010年版）的要求，并参考其他标准和文献的基础上[1-3]，对其微生物限度检查方法进行验证。

1 材料

1.1 仪器

SHP-100生化培养箱（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；LMQ.C-50K型立式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；GSP-9160MBE隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司）；DK-98-ⅡA电热恒温水浴锅（上海光学仪器一厂）；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）。

1.2 样品

芪参清幽胶囊（批号：130201，130501，130801），均来源于威海市中医院制剂室。

1.3 培养基及稀释剂

营养琼脂（批号：121025），玫瑰红钠琼脂（批号：121115），营养肉汤（批号：111205），改良马丁（批号：140114），改良马丁琼脂（批号：120113），胆盐乳糖（批号：130114），4-甲基伞形酮葡糖苷酸（批号：130827），乳糖胆盐发酵（批号：121109），曙红亚甲兰琼脂（批号：1211222），北京三药科技开发公司生产，经检查适用性符合《中国药典》（2010年版）要求。所用稀释剂为pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液。

1.4 菌种

大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]第4代，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第4代，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]第4代，白色念珠菌[CMCC（F）98 001]第4代，黑曲霉[CMCC（F）98 003]第4代，菌种均由山东省食品药品检验所提供。

2 方法

按照《中国药典》（2010年版）一部微生物限度检查法[4]附录进行。

2.1 菌液制备

2.1.1 各取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10 m L营养肉汤培养基中，经30～35℃培养18～24 h。用无菌0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至每1 m L含菌数为50～100 cfu，备用。

2.1.2 取白色念珠菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10 m L改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h。用无菌0.9%氯化钠溶液，10倍稀释至每1 m L含菌数为50～100 cfu，备用。

2.1.3 取黑曲霉的新鲜斜面培养物接种至改良马丁琼脂培养基上，23～28℃培养5～7天至大量孢子产生。加入3～5 m L含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子菌液，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至每1 m L含孢子数为50～100 cfu，备用。

2.2 供试液制备

称取样品10 g，研磨，加入45℃无菌pH 7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 m L，混匀，作为1∶10的供试液。

2.3 常规法细菌、霉菌和酵母菌验证试验

2.3.1 试验组 取1∶10的供试液1 m L和各试验菌1 m L（含菌数50～100 cfu）于无菌平皿中，然后分别倾注15～20 m L温度不超过45℃的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，分别倒置于平皿33℃培养3天或25℃培养5天。每株试验菌平行制备2个平皿。

2.3.2 菌液组 取上述各试验用菌液1 m L注入平皿内，测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 取1∶10的供试液1 m L，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

以上重复进行3次独立的平行试验，分别计算各试验菌的回收率。

表1 常规法试验细菌、霉菌和酵母菌回收率结果

2.3.4 常规法试验结果表明，本品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有抗菌作用，回收率小于70%，故不能采用常规法进行细菌数测定；但白色念菌珠菌和黑曲霉回收率大于70%，可以采用常规法进行霉菌和酵母菌数测定。

2.4 培养基稀释法细菌验证试验

2.4.1 取1∶10的供试液0.2 m L和各试验菌1 m L（含菌数50～100 cfu）于无菌平皿中[5]，方法同常规法进行试验。结果见表2。

2.4.2 试验结果表明，试验组菌数回收率均在70%以上，可采用培养基稀释法进行细菌数的测定。

表2 培养基稀释法试验细菌回收率结果

2.5 常规法控制菌检查方法验证试验

2.5.1 试验组 取1∶10的供试液10 m L及大肠埃希菌液（50～100 cfu/m L）1 m L，注入100 m L胆盐乳糖培养基中,置于30～35℃培养18～24 h。依据大肠埃希菌检查法进行试验。

2.5.2 阳性对照组 取大肠埃希菌液（50～100 cfu/m L）1 m L，注入100 m L胆盐乳糖培养基中,置于30～35℃培养18～24 h。依据大肠埃希菌检查法进行试验。

2.5.3 阴性对照组 取稀释液10 m L，注入100 m L胆盐乳糖培养基中，置于30～35℃培养18～24 h。依据大肠埃希菌检查法进行试验。

表3 常规法试验大肠埃希菌结果

2.5.4 结论 上述试验结果表明，可用常规法检查大肠埃希菌。

3 3批样品的验证

通过以上试验得知，可以用常规法进行霉菌和酵母菌数测定，也可以用常规法对控制菌进行测定，而对于细菌数的测定需采用培养基稀释法。为确保试验结果的可靠性，对该制剂按验证方法进行了3批样品（批号为131001，131002，131003）的验证。结果见表4～6。

表4 培养基稀释法试验细菌回收率结果

表6 常规法试验大肠埃希菌结果

4 讨论

芪参清幽胶囊用于治疗幽门螺旋杆菌引起的慢性胃炎，现代研究表明，方中丹参、蒲公英等对金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用，白花蛇舌草内服后抗感染作用明显，所以该制剂对微生物的生长应该具有抑制作用。通过本次验证，可以得出如下结果：常规法对于大肠埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的回收率大于70%，说明该制剂对上述菌无抑菌作用；而对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的回收率小于70%，说明该制剂对这2种菌有抗菌作用，因此需采用培养基稀释法进行试验，采取每1 m L倾注5个平皿，结果显示：后两者的回收率均大于70%；另外，常规法试验表明，该制剂对大肠埃希菌的检查无影响。所以可以用常规法对芪参清幽胶囊霉菌及酵母菌、控制菌进行检查，用培养基稀释法对细菌进行检查。通过该试验，说明对中药制剂进行微生物验证是非常必要的。

[1]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范（2010年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：351-389.

[2] 苏德模，马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京：华龄出版社，2007：209-236.

[3]赵会兰.20种中成药微生物限度检查方法验证[J].中国执业药师，2014，11（2-3）：21-24.

[4]国家药典委员会.中国药典（2010年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-88.

[5]董建英，赵会兰.黄藤素片微生物限度检查方法验证研究[J].中国执业药师，2012，9（5）：36-39.

Research on the M ethod Validation of M icrobial Lim it Test for Qishenqingyou Capsules

Liu Yuankun1,Zhang Lixian2（Hospital of Traditional Chinese Medicine of Weihai City，Shandong Weihai 264200，China；2 Jingqu Hospital of Weihai City）

Objective：To establish a method of m icrobial lim it test for qishenqingyou capsules.M ethods：According to the Chinese Pharmacopoeia of 2010 edition，the method validation of m icrobial lim it test on qishenqingyou capsules was conducted.Results:By using the conventional test methods，the antibacterial actions of qishenqingyou capsules were showed for Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus，and the recovery rate was less than 70%.The culture medium dilution method could eliminate the antibacterial activity of the product for the above two strains,and the recovery rate was greater than 70%.The conventional test methods can detect Escherichia coli in the product.Conclusion：For the product，the conventional test methods can be used for the bacterial counting test of mould or yeast and the control tests of bacteria，and the dilution method can be used for determ ination of bacteria.

Qishenqingyou Capsules；M icrobial Limit；Method Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.01.007

2014-09-10）

刘元昆，女，主管药师。研究方向：中药制剂。E-mail：zijingpi123@sina.com