益气除痰方对大鼠肺癌A549细胞的抑制作用及其机制

李晓清 安 琳 钟家芳 (重庆市中医院肿瘤科，重庆 4000)

益气除痰方对大鼠肺癌A549细胞的抑制作用及其机制

李晓清 安 琳1钟家芳2(重庆市中医院肿瘤科，重庆 400021)

目的 探讨益气除痰方对肺癌A549细胞的抑制作用及与细胞凋亡相关的机制。方法 以四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和流式细胞术碘化丙啶(PI)单染法检测益气除痰方对肺癌A549细胞活力和细胞凋亡率的影响，RT－PCR方法检测p53、bcl－2和bax的mRNA表达水平。结果

MTT法检测结果表明益气除痰方显著抑制A549细胞的生长(P＜0.05或P＜0.01)，抑制作用随药物作用时间和浓度增大而增大;流式细胞术结果表明益气除痰方对A549细胞的凋亡诱导作用随着药物剂量的增加而显著增大(P＜0.05);RT－PCR结果显示与对照组(p53基因1.58±0.91、bax基因3.27±1.55和bcl－2基因12.09±2.67)相比，益气除痰方引起p53和bax的mRNA表达显著上调(p53和bax分别为13.89±2.52和12.83±1.95，P均＜0.01)，但bcl－2的mRNA表达显著下调(9.86±2.12，P＜0.05)。结论 益气除痰方可诱导肺癌A549细胞凋亡，具有抑制其生长的作用，这可能与p53和bax表达上调、bcl－2表达下调有关。

益气除痰方;A549细胞;细胞凋亡

近年来，如何调控细胞凋亡进而影响癌症的变化已成为国内外研究者重要研究方向之一〔1～3〕，而中药日益成为临床治疗癌症的重要选用药物。由不同药材按比例调和而成的中药配方，如益气除痰汤，在临床上治疗肺癌具有良好的效果〔4，5〕。研究表明，益气除痰方能降低过氧化物还原酶(PRDX)和基质金属蛋白酶(MMP)等基因的表达，可抑制肿瘤的发展〔5，6〕。益气除痰方对肺癌的抑制机制涉及细胞生长过程及不同基因的表达调控，然而相关研究报道较缺乏。本实验通过测定益气除痰方处理后肺癌A549细胞的生长活力，及凋亡相关基因(p53、bcl－2和bax)的变化，以期为益气除痰方在临床上应用提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株 实验用肺癌A549细胞由大坪医院野战外科医院实验室提供。

1.2 材料 SD雌性大鼠，体重160～250 g，SPF级，由大坪医院野战外科动物中心提供。

试剂:①胎牛血清和碘化丙啶(PI)(北京索莱宝科技有限公司);②RPMI－1640完全培养基(美国Gibco公司);③四甲基偶氮唑盐(MTT，美国Sigma公司);④琼脂糖(美国Promega公司);⑤DNA marker(美国Promega公司)。

仪器:①Synergy 2多功能酶标仪(美国Biotek公司);②SHELLAB CO2培养箱(美国SHELLAB公司);③Stratedigm流式细胞仪(美国Stratedigm公司);④Biometra梯度PCR仪(德国Biometra公司);⑤DYY－2C电泳仪(北京市六一仪器厂);⑥BioSpectrum－UVP凝胶成像系统(美国UVP公司)。

1.3 含药血清的制备 益气除痰方包括法夏、五爪龙、枳实、人参、党参、白术、茯苓和露蜂房，按照比例 2 ∶5∶1 ∶2 ∶3 ∶3 ∶1将各药材混合粉碎，留取30目过筛后的样品煎煮成汤剂。60℃浓缩制成的药物含量为2.0 g/ml，药物分装后－20℃储存。

大鼠30只，随机分成实验组和对照组。分别以益气除痰方汤剂和生理盐水对实验组和对照组大鼠进行灌胃，每次50 ml/kg，每日早晚各1次，持续5 d。灌胃4 d后对大鼠进行饥饿处理，并在第5天给药结束1 h后从心脏抽血，置于4℃静置12 h。血样4℃、800 r/min离心20 min，收集上清液并置于56℃水浴30 min。灭活后的血清经滤膜除菌后置于EP管中，然后转入－80℃保存。

1.4 细胞培养 RPMI－1640细胞培养液包括胎牛血清10%(V/V)、青霉素和链霉素(各100 U/ml)。取细胞悬液，经RPMI－1640培养液稀释至适当浓度后，将其接种于96孔培养板(3 000个细胞/孔)。培养条件:温度 37℃、5%CO2和湿度60%。

1.5 细胞活力检测 待培养至对数期时，弃原培养液，加入含不同浓度血清的培养液进行处理，其中对照组加入30%胎牛血清(V/V)培养液，实验组加入含药血清(0% ～30%)培养液。每组包括5个复孔。实验组设0%、5%、15%、25%和30%含药血清5个梯度，按照比例RPMI－1640培养液(无药血清+含药血清)=7∶3配制而成。各组分别于培养24、48和72 h后加入20 μl MTT 溶液(0.5%)，37℃ 孵育 4 h，弃上清后加入 100 μl DMSO。室温黑暗条件下持续振荡20 min后，490 nm测定各组OD值。实验重复测定4次。细胞活力(P，%)=OD实验组/OD对照组×100%。

1.6 细胞凋亡率检测 细胞生长至对数期后，加入胰蛋白酶进行消化。计数细胞后，将其接种于培养板中(10万个/孔)。待细胞贴壁生长后，加入无血清培养液继续培养24 h，使其生长同步。弃原培养液，对照组加入无药血清培养液，而实验组加入含药血清(10%和20%)培养液。每组设5个复孔。继续培养48 h，获得的细胞以冰冷乙醇(75%)固定。PI染色后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率(%Tot，即G0期细胞所占百分比)。不同浓度梯度的培养液是按照比例RPMI－1640培养液∶(无药血清+含药血清)=8∶2配制而成。

1.7 凋亡相关基因的mRNA表达 取对数期细胞，分别加入无药血清和20%含药血清培养液。继续培养48 h后，取适量样品加入TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA，并测定提取的RNA含量(A260)和纯度(A260/A280)。取1 μg总RNA，反转录合成cDNA第一链，然后加入合成的引物进行扩增。各引物序列:p53正义:5′－AGTGTGGTGGTGCCCTATGAG－3′，反 义:5′－TTTGGACTTCAGGTGGCTGGA－3′;bcl－2 正 义:5′－TCAACACAGACCCACCAGAG－3′， 反 义:5′－AACCCCACAGCAAAAGGCAG－3′;bax 正 义:5′－TGAACAGGAGATTGGGAGTCTG－3′，反义:5′－TTGATCTGGGTCTTGGCTCG－3′;GAPDH(内 参)正 义:5′－ATCACTGCCACCCAGAAGACT－3′，反 义:5′－CATGCCAGAGGTCGGTTCGTTT－3′。PCR 设置条件:94℃ 预变性4 min;各基因循环条件均为94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s(均包含28个循环);72℃延伸5 min。扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行测定。UVP凝胶成像系统进行扫描。

1.8 统计学分析 采用SPSS13.0软件行t检验。

2 结果

2.1 不同处理肺癌细胞活力比较 0%组(即无药血清)与对照组在24、48、72 h差异均不显著(P＞0.05)。5%和15%含药血清组处理48、72 h细胞活性与对照组相比受到显著抑制(P＜0.05或P＜0.01)，而25%和30%含药血清对肺癌A549细胞活性抑制作用达到极显著水平(P＜0.01)。见表1。

表1 不同处理组肺癌A549细胞活性(±s，n=5)

表1 不同处理组肺癌A549细胞活性(±s，n=5)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

组别24 h 48 h 96 h对照组99.92±1.51 100.12±5.23 100.87±6.72 0% 100.33±2.05 99.05±2.36 98.35±5.21 5% 101.26±3.11 95.58±2.671) 91.13±6.172)15% 98.76±1.89 87.43±3.132) 83.56±4.622)25% 95.12±1.482) 78.25±2.062) 75.23±5.332)30% 91.70±3.972) 75.37±2.052) 74.35±5.282)

2.2 不同处理肺癌细胞凋亡率比较 对照组凋亡率为(2.25±0.35)%，而10%和20%含药血清组分别为(7.83±0.71)%和(13.06±0.58)%，与对照组比较差异显著(P＜0.05)。

2.3 肺癌细胞凋亡相关基因的mRNA表达水平 对照组p53、bax、bcl－2 mRNA 水平分别为 1.58±0.91、3.27±1.55、12.09±2.67。20%含药血清处理48 h后，p53和bax基因表达上调(13.89±2.52、12.83±1.95)，而 bcl－2 基因表达下调(9.86±2.12)，与对照组差异显著(P＜0.05)，见图1。

图1 两组肺癌A549细胞p53、bax和bcl-2 mRNA表达

3 讨论

细胞凋亡不仅与细胞色素等物质的变化有关，而且受到某些基因表达的调控。其中，p53和bcl－2是近年来研究较多的两大家族。p53表达上调可抑制细胞分裂并诱发细胞凋亡，从而对肿瘤的变化产生重大抑制作用〔7〕。bcl－2和 bax同属bcl－2家族，但二者mRNA表达水平在本研究中呈相反变化:前者表达下调，而后者表达上调。这种变化与二者在细胞凋亡过程中的功能不同有关:其中 bcl－2具有抑制作用，bax具有促进作用〔8，9〕，內源或外源胁迫均可刺激这两种基因的表达〔10，11〕。

本研究结果显示，实验组肺癌A549细胞的活力降低，生长受到抑制。但这种抑制作用在药物浓度较低(5% ～15%)时需较长时间(48 h)才得以显现，而在药物浓度较高(25% ～30%)时所需时间较短(24 h)，且后者抑制作用更大。同时处理后的细胞凋亡率显著增大，且随药物剂量增大而增大。研究发现，p53和bcl－2家族在肺癌细胞凋亡过程中亦发挥了重要作用〔11～13〕。在本研究中，益气除痰方处理后，p53在肺癌细胞中的表达显著上调，其可抑制参与肺癌细胞分裂有关酶的活性〔7〕。Bcl－2 家族功能的发挥与膜结构的完整性密切相关〔14〕，本研究表明益气除痰方可抑制基质金属蛋白酶(MMP)家族的表达〔6〕，从而降低胞外基质的降解〔15〕，有利于 bcl－2 家族功能的发挥。结果显示，益气除痰方处理后，肺癌细胞凋亡率显著升高，这可能与bax/bcl－2比例增加有关。因此，益气除痰方对肿瘤细胞的抑制作用，可能是正常细胞周期受到破坏和多种因素诱发细胞凋亡率升高的共同作用结果。

1 Smerage JB，Budd GT，Doyle GV，et al.Monitoring apoptosis and Bcl－2 on circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer〔J〕.Mol Oncol，2013;7(3):680－92.

2 杨建猛，林丽珠，方若鸣.益气除痰方对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡形态学的影响〔J〕.广州中医药大学学报，2013;30(4):533－6.

3 Zhang H，Sun K，Ding J，et al.Harmine induces apoptosis and inhibits tumor cell proliferation，migration and invasion through down－regulation of cyclooxygenase－2 expression in gastric cancer〔J〕.Phytomedicine，2014;21(3):348－55.

4 Li－Weber M.Targeting apoptosis pathways in cancer by Chinese medicine〔J〕.Cancer Lett，2013;332(2):304－12.

5 林丽珠，王淑美，周京旭.益气除痰方对脾虚Lewis肺癌小鼠肿瘤生长、生存期及 PRDX－1、PRDX－6表达的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2011;31(1):99－103.

6 王淑美，林丽珠，熊绍权，等.益气除痰方对肺癌系列基质金属蛋白酶表达的影响〔J〕.中药新药与临床药理，2011;22(2):135－8.

7 Jiang L，Chang J，Zhang Q，et al.MicroRNA Hsa－miR－125a－3p activates p53 and induces apoptosis in lung cancer cells〔J〕.Cancer Invest，2013;31(8):538－44.

8 Czabotar PE，Lessene G，Strasser A，et al.Control of apoptosis by the BCL－2 protein family:implications for physiology and therapy〔J〕.Nature Rev Mol Cell Biol，2014;15(1):49－63.

9 Renault T T，Teijido O，Antonsson B，et al.Regulation of Bax mitochondrial localization by Bcl－2 and Bcl－xL:Keep your friends close but your enemies closer〔J〕.Intern J Biochem Cell Biol，2013;45(1):64－7.

10 Saito K，Mori S，Date F，et al.Epigallocatechin gallate inhibits oxidative stress－induced DNA damage and apoptosis in MRL－Faslpr mice with autoimmune sialadenitis via upregulation of heme oxygenase－1 and Bcl－2〔J〕.Autoimmunity，2013;47(1):13－22.

11 Liu Y，Yang Y，Ye YC，et al.Activation of ERK－p53 and ERK－mediated phosphorylation of Bcl－2 are involved in autophagic cell death induced by the c－Met inhibitor SU11274 in Human Lung Cancer A549 Cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2012;118(4):423－32.

12 Lasithiotaki I，Antoniou KM，Derdas SP，et al.The presence of Merkel cell polyomavirus is associated with deregulated expression of BRAF and Bcl－2 genes in non－small cell lung cancer〔J〕.Intern J Cancer，2013;133(3):604－11.

13 Reinhardt HC，Schumacher B.The p53 network:cellular and systemic DNA damage responses in aging and cancer〔J〕.Trends Genet，2012;28(3):128－36.

14 董雅洁，高维娟.bcl－2、bax、caspase－3在细胞凋亡中的作用及其关系〔J〕.中国老年学杂志，2012;32(21):4828－30.

15 Velez AMA，Naranjo MMY，Avila IC，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase 1，matrix metalloproteinase 9，alpha1 antitrypsin，metallothionein and urokinase type plasminogen activator receptor in skin biopsies from patients affected by autoimmune blistering diseases〔J〕.Our Dermatol Online，2013;4(3):275－80.

R56

A

1005-9202(2015)09-2365-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.024

重庆市自然科学基金资助(cstc2014jcyjA0756)

1 重庆市中医院内分泌科 2 成都市第五人民医院康复医学二病区第一作者:李晓清(1981－)，女，硕士，主治医师，主要从事肿瘤的基础及临床研究。

〔2014－05－11 修回〕

(编辑 徐 杰)