还脑益聪方对老年认知障碍大鼠学习记忆及脑组织β淀粉样蛋白和Tau蛋白表达的影响

王晓宁 李 浩 刘剑刚 刘美霞 刘龙涛 胡 佳 魏 芸 (北京中医药大学，北京 0009)

还脑益聪方对老年认知障碍大鼠学习记忆及脑组织β淀粉样蛋白和Tau蛋白表达的影响

王晓宁1李 浩1刘剑刚1刘美霞1刘龙涛1胡 佳2魏 芸2(北京中医药大学，北京 100029)

目的 探讨补肾益气、活血解毒中药-还脑益聪方颗粒剂对认知功能障碍的自然衰老大鼠学习记忆功能及脑组织β淀粉样蛋白及Tau蛋白等表达的影响。方法 以Morris水迷宫试验检测SD老年大鼠的空间学习记忆能力，将学习记忆减退的50只老年大鼠结合体质量，分层随机方法分成为模型(老年认知障碍)对照组、阳性对照药(盐酸多奈哌齐片，0.49 mg/kg)组、还脑益聪颗粒剂小剂量(3.78 g生药/kg)组、中剂量(7.56 g生药/kg)组、大剂量(18.90 g生药/kg)组，每组10只，学习记忆能力正常老年大鼠10只为老年正常对照组给予等量水，连续灌胃14 w。给药结束后，行Morris水迷宫试验，测试老年大鼠空间学习记忆能力，免疫组织化学方法观察海马组织CA1区早老蛋白-1(PS-1)、β淀粉样肽和Tau蛋白激酶(TTBK1)的表达，积分光密度值(IOD)。结果 与正常组比较，模型组老年大鼠穿台次数显著减少(P＜0.05)，第四象限游泳路程显著缩短(P＜0.01)。给药14 w后，还脑益聪方各剂量组第四象限游泳路程显著延长(P＜0.01)，还脑益聪方大剂量组第四象限游泳时间显著延长(P＜0.05)。模型组老年大鼠海马CA1区TTBK1阳性表达明显增多，PS-1表达水平增强，β淀粉样沉积增多。经治疗后，TTBK1、PS-1和β淀粉样肽的阳性表达明显减少，和模型组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。结论 还脑益聪方可抑制脑组织β淀粉样蛋白和Tau蛋白的沉积，保护脑组织海马形态的完整性，从而改善老年认知障碍大鼠空间学习记忆能力。

还脑益聪方;认知功能障碍;自然衰老大鼠;学习记忆;β淀粉样蛋白;Tau蛋白;早老素蛋白-1

老年性痴呆亦称阿尔茨海默病(AD)的特征性病理变化主要为脑皮质弥漫性萎缩，神经元数量大量减少，大脑皮层中可见细胞内神经元纤维缠结(NFT)，细胞外老年斑(SP)等病变〔1〕。目前缺乏有效的防治方法。前期临床研究表明，还脑益聪方具有改善老年轻度认知障碍患者自由基代谢紊乱、调节脂代谢、提高脑供血以及减轻炎性免疫反应等多种作用〔2〕。动物实验亦证明，还脑益聪方具有提高老年认知障碍大鼠学习记忆能力、抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)相关结合蛋白的表达、调节脂质代谢、抑制炎症水平等综合作用，对海马细胞的凋亡具有抑制作用〔3～5〕。本研究通过观察还脑益聪方对老年认知障碍大鼠空间学习记忆能力及脑组织Aβ和Tau蛋白等表达的影响，探讨其防治老年大鼠脑组织衰老的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 还脑益聪方颗粒剂由制首乌、人参、石菖蒲、黄连、川芎组成，将人参、黄连、川芎按照质量比进行混合，并用乙醇提取，药液合并减压回收乙醇，浓缩至稠浸膏状，最后和石菖蒲挥发油包含物合并，进行制剂。实验用流浸膏生药含量约3.2 g/kg，由北京中医药大学中药学院制剂室制备。试验前用蒸馏水配制成含不同生药浓度的药液。盐酸多奈哌齐(商品名:安理申，5 mg/片)，由卫材(中国)药业有限公司生产，国药准字:H20050978，批号:100609A。

1.2 试剂 脑源性Tau蛋白激酶(兔，TTBK1/BDTK)抗体，批号:909902W;早老素蛋白-1(兔，PS-1)抗体，批号:110267，Aβ(兔，1～42)抗体，批号:110185，北京博奥森生物技术有限公司提供;即用型抗兔二步法免疫组织化学(非生物素)检测试剂盒，批号:K116616D，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，批号:K116610D，北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 仪器 DMS-2型Morris水迷宫系统，中国医学科学院药物研究所生产。Dpx View Pro型显微-彩色图像处理系统，丹麦DeltaPix公司生产。

1.4 动物 选用清洁级SD老年大鼠60只，雌雄各半，18～20月龄，体重300～500 g;青年大鼠10只，雌雄各半，4月龄，体重200～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号:SCXK(京)2006-0009。清洁级实验动物房喂养适应1 w后进行实验，动物自由摄水，室温控制在23℃ ～25℃，湿度控制在50% ～70%，光照12 h，黑暗12 h。

1.5 分组与给药 根据Morris水迷宫实验结果，以青年组大鼠平均逃避潜伏期95%正常值范围为下限，99%正常值范围为上限，将老年大鼠分为学习记忆减退组和学习记忆正常组，结合体重按照分层随机(应用SPSS13.0软件)的方法分为老年正常组、老年模型组、还脑益聪方小剂量组(3.78 g生药/kg)、还脑益聪方中剂量组(7.56 g生药/kg)、还脑益聪方大剂量组(18.90 g/kg生药)和阳性对照组(盐酸多奈哌齐片，0.49 mg/kg)。老年正常组、老年模型组予等体积蒸馏水灌胃，所试药物稀释同等倍数，灌胃量为1 ml/100 g，连续灌胃14 w。在灌胃过程中，由于实验人员操作不当，致使4只老年大鼠呛死。动物实验过程中严格遵守动物伦理学要求。

1.6 检测指标

1.6.1 动物行为学测试 连续用药14 w后以Morris水迷宫试验检测行为学。Morris水迷宫直径120 cm，水深30 cm，水面高出站台表面约1 cm，水温(25±1)℃。将水池以四个等距离点分为四个象限区，在第四象限池壁与圆心中间放置站台。池中加入适量墨汁，混匀，使水呈不透明黑色，达到动物视觉不能辨别池内站台位置及有无站台的目的。本试验包括定位航行试验和空间探索试验，分别用于训练大鼠在水迷宫中的学习记忆能力和对站台空间位置的记忆能力。1次/d，连续训练5 d。从池壁第二象限1/2弧度处选择并标记一个入水点，将大鼠从第二象限标记处逐一放入水池中，放入时将大鼠面向池壁，自动录像系统记录大鼠从入水至找到平台并爬上平台所需的时间(以四肢爬上平台为准)，即逃避潜伏期(PLL)。如大鼠在3 min内未找到平台，则由实验者将其引导至平台，潜伏期最长时间为180 s。待大鼠爬上平台并在平台上休息10 s后，再进行下一只大鼠的试验。第5天下午撤除站台，随机选取一点，面向池壁将大鼠放入水池中，摄像系统自动记录大鼠3 min内进出原平台区的次数及在原平台所在第四象限游泳时间、路程等作为评价大鼠学习成绩的指标。

1.6.2 免疫组化法检测脑组织PS-1、Aβ和TTBK1的表达

随机选取5只老年大鼠脑组织病理切片，利用非生物素二步法进行免疫组织化学的检测。石蜡包埋常规处理，连续切片约5 μm厚，捞片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上。根据试剂盒说明书严格操作，一抗tau蛋白激酶抗体(稀释比例1∶400)、PS-1 抗体(1∶400)、Aβ(1∶400)，37℃孵育 1 h，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，2 min×3次;滴加二抗，兔抗山羊IgG抗体-辣根过氧化物酶(HRP)多聚体，室温孵育30 min，PBS溶液冲洗，2 min×3次;DBA显色，显微镜下观察，镜下控制反应时间，待组织着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液;蒸馏水充分冲洗，苏木素轻度复染，乙醇脱水、透明、中性胶封片。

免疫组化染色结果图像分析:观察每组5只老年大鼠脑的病理切片，每张切片在海马CA1区选取3个连续的不同视野，每组共15个视野。以Dpx View Pro型显微-彩色图像处理系统采集图像和分析，采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件统计每组阳性表达的积分光密度值(IOD)，取平均值。1.7 统计学方法 应用SPSS13.0软件行统计学分析，计量数据以±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD 检验。

2 结果

2.1 对老年大鼠空间学习记忆能力的影响 与老年正常组大鼠相比，老年模型组大鼠穿台次数显著减少(P＜0.05)，在第四象限游泳路程显著缩短(P＜0.01)。与老年模型组大鼠比较，还脑益聪方小、中、大剂量组在第四象限游泳路程显著延长(P＜0.01)，还脑益聪方大剂量组在第四象限游泳时间显著延长(P＜0.05)。见表1。

表1 各组老年大鼠空间学习记忆能力(±s)

表1 各组老年大鼠空间学习记忆能力(±s)

与老年正常组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与老年模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01;下表同

组别 n 穿台次数(次)第四象限路程(cm)第四象限时间(s)58.28±8.54老年模型组 10 5.70±3.271) 356.57±64.422)4) 50.68±8.09阳性对照组 9 8.00±3.54 574.25±129.264) 58.23±14.67中药小剂量组 10 5.90±2.56 542.72±167.064) 55.49±8.88中药中剂量组 8 5.88±2.53 585.52±106.084) 55.88±7.26中药大剂量组 9 6.33±1.94 592.72±119.644)60.25±7.263)老年正常组 10 8.40±3.723) 620.18±100.954)

2.2 对老年大鼠海马CA1区PS-1、Aβ和TTBK1表达的影响

自然衰老大鼠海马组织CA1区PS-1免疫反应阳性产物呈棕黄色细颗粒状，Aβ免疫反应阳性产物呈棕黄色或棕褐色细颗粒状TTBK1免疫反应阳性产物呈棕褐色细颗粒状，主要分布于神经元胞质和胞膜。与老年正常组大鼠相比，老年模型组海马CA1区PS-1阳性表达IOD值显著升高(P＜0.01);与老年模型组大鼠相比，还脑益聪方小、中、大剂量组海马CA1区PS-1 Aβ、TTBK1阳性表达 IOD 值均显著下降(P＜0.01)。见表 2，图1～图3。

图1 各组老年大鼠海马CA1区PS-1表达(×600)

图2 各组大鼠海马CA1区Aβ表达(×600)

图3 各组大鼠海马CA1区TTBK1表达(×600)

表2 各组大鼠海马CA1区PS-1、Aβ和TTBK1表达(±s，n=5，IOD 值)

表2 各组大鼠海马CA1区PS-1、Aβ和TTBK1表达(±s，n=5，IOD 值)

TTBK1老年正常组 4 476.84±1 045.564) 4 322.54±900.294) 4 506.62±925.494)组别 PS-1 Aβ老年模型组 7 344.64±1 336.612) 7 855.90±1 019.452) 7 860.92±1 216.972)阳性对照组 5 237.14±1 075.024) 5 414.43±950.002)4) 5 241.64±762.681)4)中药小剂量组 6 228.52±1 420.682)4) 6 103.87±1 240.992)4) 6 194.99±1 210.732)4)中药中剂量组 5 927.08±843.712)4) 5 933.00±766.922)4) 5 734.91±758.382)4)中药大剂量组 4 884.38±890.824) 4 992.04±771.374) 4 862.89±836.874)

3 讨论

研究表明，胆碱能神经元丢失、NFTs和SP的形成是AD的主要病理学特征〔6〕。NFTs主要由微管相关蛋白Tau蛋白过度磷酸化形成，SP的主要成分是Aβ，而Aβ主要由淀粉样前体蛋白(APP)经γ-分泌酶和β-分泌酶(BACE)的催化裂解产生，Aβ即是APP的一部分片段〔7〕，γ-分泌酶是一种复杂的多亚基复合体，一般认为其主要由PS-1等4部分组成〔8〕，但也有学者认为PS-1本身就是γ-分泌酶〔9〕。学习记忆能力是大脑的一项重要功能，也是构成智能的重要因素。在大脑中，海马是负责学习和记忆的结构，海马分为齿状回和海马回两部分，而海马回又分为CA1、CA2、CA3、CA4四个部分，其中CA1区是学习记忆、信号传递及信息处理的重要部位〔10〕。近年来，多项相关文献〔8～10〕指出，老年大鼠海马CA1区PS-1和Aβ阳性反应较强，神经细胞磷酸化tau蛋白阳性细胞明显增多。

本实验采用学习记忆能力减退的自然衰老大鼠作为认知障碍动物模型，虽然正常老化与AD有着本质的区别，但衰老是导致AD的原因之一，是老年性痴呆的最大危险因素。选择自然衰老的大鼠，更符合衰老因素在AD发病过程中的重要作用〔11〕。本研究结果说明老年模型组大鼠存在认知功能减退;还脑益聪方可显著改善认知障碍大鼠受损的学习记忆能力。免疫组织化学结果表明，还脑益聪方可以通过减少该模型大鼠脑组织PS-1、Aβ和TTBK1的表达，减少衰老相关蛋白对脑组织的损害，进而保护老年大鼠的学习记忆功能。

中医学认为，痴呆的病理性质以本虚标实、虚实夹杂为主。肾虚精亏为本，痰瘀互阻为标;肾虚精亏、脑失充养，故出现记忆、精神、智能等方面障碍;痰瘀阻窍，形成智能障碍及痴呆的基本病理表现〔12〕。还脑益聪方基于“虚-瘀-浊-毒”为 AD的基本病机理论，全方由制首乌、人参、石菖蒲、黄连、川芎组成。其中制首乌能养血益肝，固精益肾，为君药，首乌中的有效成分二苯乙烯苷具有抗痴呆的药理作用;人参可补脾益肺，安神益智，其有效成分人参皂苷具有保护神经元、提高脑组织摄氧能力以及对血氧的利用率，从而改善智力状况的作用。石菖蒲有开窍醒神，辟秽化浊，益心安神之功效，石菖蒲挥发油可明显改善痴呆大鼠学习记忆能力。黄连具有清热燥湿、泻火解毒的功效，黄连中的有效成分黄酮类化合物具有抗氧化作用，生物碱类化合物还可抑制乙酰胆碱酯酶的活性，以及通过作用于某些炎性细胞和炎性介质发挥抗炎作用。川芎能活血行气，川芎提取物川芎嗪可明显提高痴呆模型的学习记忆能力，还可改善中枢海马胆碱能系统功能。以上诸药配伍，标本兼治，共奏补肾益气、活血通络、化痰祛浊、清热解毒之效。

1 刘剑刚，李 浩，姚明江，等.还脑益聪方对老龄大鼠学习记忆及脑组织β类淀粉样蛋白P物质水平的影响〔J〕.中国实验方剂学杂志，2010;16(2):52-5.

2 李 浩，姚明江，赵文明，等.还脑益聪胶囊治疗老年轻度认知损害的双盲随机对照研究〔J〕.中西医结合学报，2008;6(1):25-31.

3 李 浩，刘剑刚，姚明江，等.还脑益聪方对老龄认知障碍大鼠脂质代谢和海马内质网Aβ相关结合蛋白表达的影响〔J〕.中国中医基础医学杂志，2009;15(5):354-7.

4 姚明江，刘剑刚，李 浩，等.还脑益聪方对早期认知功能障碍大鼠血浆P-选择素、血浆纤溶酶原激活物抑制剂和血液流变学指标的影响〔J〕.中国微循环，2009;13(4):254-8.

5 李 浩，姚明江，徐 立，等.还脑益聪方对认知功能障碍大鼠认知功能及海马Bcl-2，Bax蛋白表达的影响〔J〕.中国中药杂志，2009;34(20):2622-5.

6 Chui HC，Zarow C，Mack WJ，et al.Cognitive impact of subcortical vascular and Alzheimer′s disease pathology〔J〕.Ann Neurol，2006;60(6):677-87.

7 Zhang YW，Xu H.Molecular and cellular mechanisms for Alzheimer′s disease:understanding APP metabolism〔J〕.Curr Mol Med，2007;7(7):687-96.

8 鄢 浩，姜凤超.γ-分泌酶抑制剂研究进展〔J〕.化学进展，2006;18(3):355-62.

9 Kimberly W，Wolfe M.Identity and function of gamma-secretase〔J〕.Neurosci Res，2003;74(3):353-60.

10 White AM，Mattews DB，Best PJ.Ethanol，memory，and hippocampal function:a review of recent findings〔J〕.Hippocampus，2002;10(1):88-93.

11 Rosenzweig ES，Barnes CA.Impact of aging on hippocampal function:Plasticity，network dynamics，and cognition〔J〕.Prog Neurobiol，2003;69(3):143-79.

12 粟明兰.老年痴呆辨证内外并治〔J〕.辽宁中医药大学学报，2009;11(9):81-2.

Effects of Huannao Yicong decoction on learning and memory，and the expressions of β-amyloid protein and TTBK1 in aging rats with cognitive impairment

WANG Xiao-Ning，LI Hao，LIU Jian-Gang，et al.
Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China

ObjectiveTo observe the effects of Huannao Yicong decoction(HYD)on learning and memory function，the expressions of β-amyloid(Aβ)protein and TTBK1 in aging rats with cognitive impairment.MethodsMorris water maze test was used to measure the spatial learning and memory of SD aging rats.50 aging rats with learning and memory impairment combining with weight were divided randomly into model(aged rats with cognitive impairment)，positive control(Hydrochloric donepezil Tablets，0.49 mg/kg)，HYD granules small-dose(3.78 g crude drug/kg)，middle-dose(7.56 g crude drug/kg)，big-dose groups(15.12 g crude drug/kg)，10 in each group.The learning and memory capacity was tested by Morris water maze.The expressions of PS-1，Aβ protein and TTBK1 in hippocampus organization CA1 region were detected by immunohistochemical method.ResultsComparing with those of normal aged rats group，the number of model group aged rats passing the platform and the swimming distance in the fourth quadrant were significantly decreased(P＜0.01).After 14 weeks treatment，the swimming distance in the fourth quadrant of each HYD group were significantly increased(P＜0.01)，the swimming time in the fourth quadrant of big-dose group was significantly increased(P＜0.05).The expressions of PS-1，TTBK1 and β-amyloid protein were significantly increased in hippocampus CA1 area of the model groups.After treatment，the expressions of PS-1，TTBK1 and β-amyloid proteins were significantly decreased(P＜0.05，P＜0.01).ConclusionsHYD could reduce the deposition of Aβ protein and TTBK1 in brain tissue，protect the integrity of histomorphology in the hippocampus，and thus improve the spatial learning and memory capacity of aged rats with cognitive impairment.

Huannao Yicong Decoction;Cognitive impairment;Natural aging rats;Spatial learning and memory;β-amyloid protein;Tau tubulin kinase;Presenilin-1

R-332;R259

A

1005-9202(2015)09-2336-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.09.013

国家“重大新药创制”科技重大专项课题(2009ZX09103-391)

1 中国中医科学院西苑医院

2 北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室

刘剑刚(1963-)，男，副研究员，主要从事心血管中药药理、生物流变学的临床和基础研究。

王晓宁(1968-)，女，博士，主要从事中西医结合治疗心脑血管疾病研究。

〔2014-07-04修回〕

(编辑 袁左鸣)