胰高血糖素样肽-1对人脂肪干细胞增殖、成脂分化及脂代谢的影响*

邹玲玲，戴武，鲁红云，刘红，李玲玲，孙辽，谢丹红

（1.安徽省合肥市第二人民医院内分泌科，安徽 合肥 210000；2.中山大学附属第五医院内分泌科，广东 珠海 519000）

·论著·

胰高血糖素样肽-1对人脂肪干细胞增殖、成脂分化及脂代谢的影响*

邹玲玲1，戴武2，鲁红云2，刘红2，李玲玲2，孙辽2，谢丹红2

（1.安徽省合肥市第二人民医院内分泌科，安徽 合肥 210000；2.中山大学附属第五医院内分泌科，广东 珠海 519000）

目的研究胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对人脂肪干细胞（ASCs）增殖、成脂分化及脂代谢的影响。方法胶原酶分离法原代培养人ASCs，体外扩增及传代建立稳定的培养体系。用含有不同浓度GLP-1（0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L）的基础培养基和成脂分化培养基培养细胞，噻唑蓝法（MTT）检测干预24、48及72 h后细胞增殖情况，分化21 d后行油红O染色、异丙醇萃取法检测细胞内脂质含量，同时测定分化过程中上清液中甘油释放量作为脂质分解的指标，测定细胞裂解液中三酰甘油的含量作为脂质合成指标。结果①高浓度的GLP-1（100.0 nmol/L）对人ASCs的增殖具有抑制作用，且随着时间的延长抑制作用更明显。②油红O染色及异丙醇萃取法显示100.0 nmol/L的GLP-1抑制人ASCs的成脂分化。③在人ASCs成脂分化过程中，高浓度的GLP-1（100.0 nmol/L）可促进甘油的释放，而对细胞内三酰甘油的含量影响不大。结论高浓度GLP-1可抑制人ASCs的增殖及成脂分化，促进脂质分解，对脂质合成无明显作用。

胰高血糖素样肽-1；人脂肪干细胞；细胞增殖；成脂分化；脂质代谢

2型糖尿病发病率逐年上升，现已成为全球性的公众卫生问题。胰高血糖素样肽-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）作为一种新型降糖药物，具有降低血糖、保护胰岛β细胞及降低体重等特点，现已成为糖尿病药物治疗的新热点。GLP-1可以显著地降低体重，其机制有多方面原因，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌，延缓胃排空，抑制食欲及减少摄食[1-2]。至于GLP-1是否直接作用于脂肪组织和脂肪细胞从而影响脂代谢，目前报道并不多见。本研究主要探讨GLP-1对人脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ASCs）增殖、分化的作用及对脂质合成与分解的影响，从细胞水平探讨其减轻体重的机制，也为其用于治疗其他代谢性疾病，如肥胖症、血脂异常等提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂DMEM/F12培养基（美国Corning公司），胎牛血清（杭州四季青公司），I型胶原酶、牛血清白蛋白（BSA）、1-甲基-3-异丁醇黄嘌呤（IBMX）、甲状腺素、地塞米松、胰岛素、泛酸钙、生物素、转铁蛋白及噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶-EDTA、β-甘油磷酸钠、维生素C、巴比妥钠、氯化钙、硫酸镁、硝酸钴、硫化铵及甲苯胺蓝购自广州翔博生物公司，胰高血糖素样肽-1[GLP-1（7-37）]（美国ProSpec公司），油红O（广州杰特韦生物公司），甘油含量测定试剂盒购自上海荣盛生物公司，三酰甘油测定试剂盒购自南京建成生物公司。

1.1.2脂肪组织来源选择中山大学附属第五医院普外科择期行开腹手术患者，年龄小于50岁，无感染和恶性肿瘤转移，无内分泌及全身代谢性疾病，无服用干预糖及脂肪代谢的药物史。知情同意下切取腹部皮下脂肪组织约10 g。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1人ASCs的原代培养及鉴定参照笔者已建立的方法[3]取新鲜切除的脂肪组织，胶原酶消化，红细胞裂解液裂解红细胞，离心弃上清，沉淀用基础培养基制成细胞悬液，接种于培养瓶，37℃，5%二氧化碳CO2培养箱中培养。当ASCs生长覆盖至80%左右时传代。使用流式细胞仪检测CD44、CD105及人白细胞（位点）DR抗原[human leukocyte antigen（locus）DR，HLA-DR）]等表面抗原。

1.2.2人ASCs的多向诱导分化取4～10代的ASCs以5×105个/ml的密度接种于培养板，待细胞长满培养板后，分别加入成脂、成骨及成软骨分化培养基进行多向诱导分化。成脂分化液配方：DMEM/F12，地塞米松1μmol/L、胰岛素1μg/ml，甲状腺素0.2 nmol/L、生物素33μmol/L、泛酸钙17μmol/L、转铁蛋白10 mg/L，青霉素100 u/ml，链霉素0.1 mg/mL，前3 d的分化培养基中含IBMX 0.5 mmol/L，分化21 d后行油红O染色。成骨分化液配方：DMEM/F12，10%胎牛血清，β-甘油磷酸钠10 mmol/L，地塞米松0.1μmol/L，维生素C 50 mg/L；孵育液配制：3%β-甘油磷酸钠5 ml，2%巴比妥钠5 ml，蒸馏水10 ml，2%氯化钙10 ml，2%硫酸镁1 ml。分化至第14天时，行碱性磷酸酶（ALP）染色。成软骨分化液配方：DMEM/F12，1%胎牛血清，1%双抗，胰岛素6.25μg/ml，TGF-β1 10 ng/ml，维生素C 50 nmol/L。诱导分化至第14天时行甲苯胺蓝染色。

1.2.3不同浓度GLP-1对人ASCs增殖的影响

取同一患者同一代次的ASCs，以104/ml的密度接种于96孔板，每孔100μl，分别以含不同浓度GLP-1（0、0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L）的基础培养基培养细胞，设置空白对照组（不添加细胞和GLP-1），每日1次倒置显微镜下观察细胞形态，照相。当细胞生长至培养孔面积的50%～60%时，分别行24、48和72 h MTT检测。实验重复3次（n=3），每次8复孔取平均值（n=8）。

1.2.4GLP-1对人ASCs成脂分化的影响用含不同浓度GLP-1（0、1.0、10.0及100.0 nmol/L）的成脂分化液进行成脂分化。分化直至21 d油红O染色，倒置显微镜下观察人前脂肪细胞分化的情况，并用异丙醇萃取的方法进行细胞内脂质含量的定量检测（以吸光度A值表示）。设置空白对照组（不添加细胞和GLP-1）、阴性对照组（不添加GLP-1），通过与对照组的比较，分析GLP-1对人ASCs分化的影响。

1.2.5GLP-1对人ASCs成脂分化过程中脂质代谢的影响收集分化第6，12，18和21天细胞上清液1 ml，存放于-20℃冰箱；同时裂解细胞，收集裂解液4℃12 000 g离心10 min，取上清-20℃冰箱保存。所有标本收集后集中检测。细胞内三酰甘油含量及培养基中甘油的释放量作为脂质合成与分解的指标，具体方法按照试剂盒操作说明进行。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，实验组与对照组两两比较，方差齐时采用LSD-T（最小显著差异法）检验，方差不齐时采用Dunnett-T检验，数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1原代培养的人ASCs形态学观察

细胞刚接种时呈悬浮状，12 h后显微镜下观察发现细胞基本贴壁，初为类圆形，体积较小，后变为纺锤形或不规则形，逐渐出现伸展趋势。第3天左右细胞呈现典型的长梭形，开始迅速增殖，第10天左右细胞大量增殖，融合成漩涡状，排列紧密。第1～3代的细胞尚含有一些红细胞及其他杂细胞，经过不断换液及消化后传代，3代以后的细胞形态均一，呈长梭形，旋涡状生长，细胞较纯净，可做下一步研究。

2.2人ASCs的鉴定

经流式细胞仪表面抗原检测，人前脂肪细胞表面CD44及CD105成强阳性，表达率均超过98%，而CD31、CD34、CD45及HLA-DR阴性。其中，CD44和CD105是骨髓间充质干细（MSCs）公认的两种表面标志，说明所培养的前脂肪细胞具有干细胞的特性。

2.3人ASCs的多向诱导分化

经油红O染色可观察到变大变圆的脂肪细胞和胞质内大小不等的脂肪滴被染成橘红色，而未分化的ASCs则不能被染色（图1）；经碱性磷酸酶染色后可见胞质中呈现灰黑色颗粒或块状沉淀（图2）；经甲苯胺蓝染色可见甲苯胺蓝与软骨基质中的氨基葡聚糖结合，从而使基质着蓝紫色（图3）。

2.4MTT结果显示

与空白组相比，干预48 h后100.0 nmol/L组ASCs的增殖受抑制，差异有统计学意义；干预72 h后10.0和100.0 nmol/L组均对ASCs的增殖均有抑制作用，差异有统计学意义，如表1。

2.5GLP-1对人ASCs成脂分化的影响

通过油红O染色后异丙醇萃取的结果显示：与对照组相比，高浓度的GLP-1（100.0 nmol/L）对人ASCs的成脂分化具有抑制作用，差异具有统计学意义，如表2。

2.6 GLP-1对人ASCs成脂分化过程中脂质分解的影响

表3结果显示：分化第21天，100.0 nmol/L组甘油含量高于对照组，差异有统计学意义。而且随着分化时间的延长，高浓度GLP-1促进脂肪分解的作用更明显。

2.7GLP-1对人ASCs成脂分化过程中脂质合成的影响

表4结果显示：随着分化时间的延长，细胞内的三酰甘油含量逐渐增加，差异有统计学意义。但随着分化液中GLP-1浓度的增加，各组细胞内三酰甘油含量差异无统计学意义。

表1 GLP-1对人前脂肪细胞增殖的影响[吸光度（A），（±s）]

注：†各GLP-1浓度组与不加GLP-1组比较，P＜0.05

时段0 nmol/L10.0 nmol/L100.0 nmol/LF值P值24 h0.192±0.0700.210±0.1020.207±0.0740.660.652 48 h0.290±0.0600.241±0.0360.282±0.065†3.190.013 72 h0.524±0.0500.394±0.104†0.430±0.052†12.120.002 0.1 nmol/L1.0 nmol/L 0.181±0.0710.181±0.070 0.316±0.0870.281±0.072 0.493±0.0360.4860.045

表2 异丙醇萃取油红O结果（±s）

注：†与0 nmol/L组相比，P＜0.05

GLP-10 nmol/L 10.0 nmol/L100.0 nmol/L吸光度值0.618±0.0170.576±0.0230.542±0.023†t值1.642.84 P值0.1610.013 0.1 nmol/L1.0 nmol/L 0.594±0.0170.601±0.025 0.830.63 0.4130.574

表3 GLP-1对人ASCs分化过程中培养基甘油含量的影响（μmol/L±s）

注：1）各浓度GLP-1组与未加GLP-1组相比，P＜0.05；2）各浓度GLP-1组与未加GLP-1组相比，P＜0.01

GLP-10 nmol/L10.0 nmol/L100.0 nmol/LF值P值第6天236.25±18.94264.06±54.32251.56±47.401.120.382 0.1 nmol/L1.0 nmol/L 311.25±24.26237.81±27.91第12天157.81±44.60306.25±33.431）287.5±29.032.150.125 226.88±64.40308.16±40.241）第18天125.63±7.23226.88±16.772）228.75±25.512）8.530.001第21天163.44±45.23238.13±48.35398.75±25.192）5.320.007 135.63±15.25161.25±14.60 259.69±48.51186.56±24.17

表4 GLP-1对人ASCs细胞内三酰甘油含量的影响[mmol/（L·g）±s]

时段0 nmol/L10.0 nmol/L100.0 nmol/LF值P值第6天2.970±0.1322.755±0.1822.478±0.3600.430.123 0.1 nmol/L1.0 nmol/L 2.748±0.2272.540±0.470第12天5.578±0.3115.338±0.2825.138±0.1230.580.311 5.498±0.2275.150±0.320第18天9.032±0.1998.545±0.2178.298±0.0610.920.199第21天11.090±0.28110.578±0.42510.503±0.2591.030.281 8.755±0.3908.548±0.407 11.143±0.18310.743±0.233

3 讨论

脂肪组织主要由ASCs、脂肪细胞、血管基质细胞、少数纤维母细胞和少量细胞间胶质组成，它不仅是被动的能量存储库，还具有复杂的内分泌调节功能。自2001年ZUK等发现ASCs以来，就已证明ASCs具有向脂肪、软骨、成骨或成肌等多向分化潜能，它的存在和作用持续于人的一生[4]。脂肪细胞处于不断自我更新的过程中，旧的脂肪细胞衰老、凋亡，而在适当的诱导分化条件下，ASCs可以不断分化为脂肪细胞，新的脂肪细胞不断募集[5-7]。因此建立脂肪细胞的增殖分化模型，可为深入研究肥胖及相关疾病的发病机制提供细胞学平台。

如前文所述，GLP-1具有确切的降低体重的作用，其机制也被广泛探讨。然而GLP-1是否直接作用于脂肪组织、对ASCs的增殖及分化是否有影响及何种影响，目前不甚明了。笔者知道ASCs增殖、分化功能的紊乱可导致脂肪细胞数量的增加和体积的增大，从而造成内分泌和代谢的紊乱，引起肥胖。因此，本实验从细胞增殖、分化角度探讨GLP-1对ASCs的影响，以期从细胞水平进一步探讨其降低体重的机制。

本研究发现，GLP-1干预48 h后，与不加GLP-1的对照组相比，100 nmol/L组的细胞增殖受到明显抑制，差异具有统计学意义。而到了第3天，10及100 nmol/L组均对细胞增殖起到抑制作用，差异具有统计学意义。较低浓度GLP-1（1及0.1 nmol/L）对人ASCs的增殖无明显影响。根据以上结果，笔者推断GLP-1对人ASCs的增殖具有抑制作用，并且这种抑制作用随着GLP-1浓度的增加及培养时间的延长会更加显著。笔者还采用不同浓度的GLP-1干预人ASCs的成脂分化过程，发现含100.0 nmol/L的GLP-1试验组对细胞的成脂分化有明显抑制作用，虽然其他浓度的GLP-1实验组对人ASCs成脂分化无明显影响，但总体看来，与对照组相比，各实验组仍然呈降低的趋势。由此笔者认为GLP-1对人ASCs的成脂分化具有抑制作用。

GLP-1生物活性的发挥主要通过其受体（glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1R）介导。GLP-1R属于G蛋白耦联受体B家族，是由7个跨膜结构组成的受体蛋白，THORENS[8]等在1992年克隆出该受体。研究者首先在胰腺中发现了GLP-1R，随后在心脏、脑、肺及肾脏等器官均发现GLP-1R序列的存在。而在利用葡萄糖的主要外周组织，如肝脏、骨骼肌和脂肪组织已被证实存在高亲和力的GLP-l结合位点[9]，但未能检测出已知的受体序列。在胰腺，GLP-1与经典的GLP-1R结合，通过G蛋白偶联受体-cAMP信号途径促进胰岛β细胞增殖[10]。而本研究的结果表明GLP-1对ASCs的增殖具有抑制作用。为什么同一药物在不同组织细胞中呈现相反的作用呢？有学者推测在脂肪组织中一直未能发现已被克隆的胰岛细胞表面的受体存在，因此怀疑在脂肪组织中存在的GLP-1结合位点和胰岛β细胞表面的受体不同[11-12]。GLP-1与人ASCs表面的结合位点结合后经不同的受体后转导通路，从而导致了GLP-1作用于不同组织细胞产生不同的作用[13]。这其中具体机制尚需进一步研究。

脂质是人体的重要组成成分和储能物质，人体内含量最多的脂质是三酰甘油，人体大多数组织都可以利用三酰甘油，在一系列脂肪酶的作用下可将三酰甘油分解为脂肪酸和甘油，从三酰甘油中脱离的脂肪酸即游离脂肪酸（free fatty acid，FFA），是一种能够迅速用于生命活动的高效热量源。在生活水平不断提高、食材更加丰富的今天，现代人却面临着FFA过度蓄积的危险。在肥胖和2型糖尿病的病理生理过程中就常伴有FFA的升高。FFA的升高与胰岛素抵抗和β细胞功能异常有着密切的关系。本研究中，笔者发现随着人ASCs分化时间的延长，细胞内三酰甘油含量逐渐增加，而分化培养基中GLP-1的浓度对三酰甘油含量无明显作用，说明GLP-1对于脂质合成无明显效应。另一方面，在人ASCs成脂分化过程中，含有高浓度GLP-1的分化液中甘油的含量明显高于对照组，且随着分化时间的延长这种差异更明显，说明高浓度的GLP-1可促进人脂肪细胞的脂肪分解。这与既往SANCHO V等[14]的研究结果不一致，考虑人脂肪细胞和动物脂肪细胞对GLP-1在脂肪细胞中产生作用所需的浓度数量级要求不同，同时两种不同种属来源的细胞在代谢途径上也存在差异，因此造成了实验结果的差异。当然，GLP-1在脂代谢中具体的分子生物学机制还有待于深入研究。

综上所述，本研究发现高浓度GLP-1抑制人ASCs增殖、成脂分化同时又促进脂肪分解的作用，可能正是GLP-1降低体重的原因之一。这一作用更好地解释了GLP-1应用于临床糖尿病的治疗，同时也为其应用于肥胖症等其他代谢性疾病的治疗提供了方向。另外，GLP-1除了目前已知的降糖、减重作用外，还具有舒张血管、降压及保护内皮细胞等的心血管保护作用，这为减少糖尿病患者心血管系统并发症提供可能。这其中的具体机制目前尚不明确。当然，本实验中GLP-1使用的浓度范围与临床实际有一定差异，GLP-1在临床应用中带来的恶心、呕吐甚至急性胰腺炎、肾脏损害等副反应，以及其高浓度代谢产物在体内是否会增加对心脏、肝脏及血管系统的损害风险，还需在以后的治疗应用中提供更多临床研究的支持。

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Effects of glucagon like peptide-1(GLP-1)on the proliferation,adipogenesis and lipid metabolism of human adipose-derived stem cells*

Ling-ling ZOU1,Wu DAI2,Hong-yun LU2,Hong LIU2,Ning-ning LI2,Liao SUN2,Dan-hong XIE2
(1.Department of Endocrinology,the Second People's Hospital,Hefei,Anhui 210000,P.R.China; 2.Department of Endocrinology,the Fifth Hospital affiliated to Sun Yat-sen University, Zhuhai,Guangdong 519000,P.R.China)

【Objective】To investigate the effects of GLP-1 on the proliferation,adipogenesis and the lipid metabolism in the course of the adipogenesis of human adipose-derived stem cells(ASCs).【Methods】Human ASCs were separated from subcutaneous adipose tissue by collagenase I and cultured and induced to adipogenesis in the presence of GLP-1 of different concentrations(0,0.1,1.0,10.0,100.0 nmol/L)Oil red O staining and isopropanol extraction methods were used to assess intracellular lipid accumulation.Supernatant of cell culture medium was collected every 3 day to measure glycerol as lipolysis index,cell lysate was collected to measure triglyceride as lipid synthesis index.【Results】Human ASCs were successfully cultured from subcutaneous adipose tissue,and can be induced to osteogenic,adipogenic and chondrogenic differentiation in vitro.MTT results showed that the proliferative activity of human ASCs was attenuated by GLP-1 on higher concentration[A(0.430±0.052)vs(0.290±0.060),P＜0.01].Oil red O staining showed that GLP-1 on higher concentration(100.0 nmol/L)inhibited the differentiation of human ASCs[A(0.542±0.023)vs(0.618±0.017),P＜0.05].During the course of the human ASCs adipogenesis, GLP-1(100 nmol/L)accelerated the release of glycerol[(398.75±25.19)μmol/L vs(163.44±45.23)μmol/L,P＜0.01],but had no effect on the content of intracellular triglyceride accumulation[(10.503±0.259)mmol/L/g vs(11.090±0.281)mmol/L/g,P＞0.05].【Conclusion】GLP-1 can inhibit the proliferation and adipogenesis of human ASCs in vitro,promote lipolysis,but has no effect on lipid synthesis.

GLP-1;human adipose-derived stem cells;cell proliferation;adipogenesis;lipid metabolism

R589

A

1005-8982（2015）28-0001-06

2015-04-12

广东省科学技术厅社会发展计划项目（No：2011B031800102）

鲁红云，E-mail：luhongyun2013@163.com，Tel：13902533020