P21活化激酶6在结肠癌组织中的表达及其意义

王飞，李建国，吴巧斌，邓龙，罗杰，李再晔

（1.福建医科大学附属漳州市医院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正兴医院肝胆胰脾诊疗中心，福建 漳州 363000；3.中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410013）

·论著·

P21活化激酶6在结肠癌组织中的表达及其意义

王飞1，李建国2，吴巧斌1，邓龙1，罗杰1，李再晔3

（1.福建医科大学附属漳州市医院普一科，福建 漳州 363000；2.福建省漳州正兴医院肝胆胰脾诊疗中心，福建 漳州 363000；3.中南大学湘雅医学院，湖南 长沙 410013）

目的探讨P21活化激酶6（PAK6）在结肠癌组织的表达水平及临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR/qPCR）检测25例结肠癌患者肿瘤组织、配对的癌旁正常组织PAK6基因的mRNA表达水平，通过免疫组织化学的方法检测94例结肠癌及其癌旁正常组织PAK6的蛋白表达水平，并结合临床资料进行相关分析。结果qPCR显示肿瘤组织中PAK6 mRNA的表达水平显著高于癌旁正常组织（P＜0.01）。免疫组织化学显示PAK6在正常组织低表达10.64%（10/94），在肿瘤组织中高表达64.89%（61/94）；PAK6的表达量与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化、Ki67表达水平和肿瘤远处转移显著相关（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示PAK6阳性组患者5年无病生存率及总体生存率均明显低于PAK6阴性组（P＜0.01）；多因素COX回归模型分析发现PAK6高表达是影响结肠癌预后相关的独立危险因素。结论PAK6在结肠癌组织中高表达，与肿瘤分期、分化及远处转移相关，可作为结肠癌预后判断的指标。

结肠癌；PAK6；预后

P21活化激酶（p21-activated kinases，PAKs）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为P21活化激酶的6个家族成员之一，可通过下游众多的激酶底物和结合蛋白参与众多的生物学功能，被认为是肿瘤细胞信号网络的关键调节因子，在细胞骨架重组、细胞迁移、细胞凋亡及基因转录调节等方面起重要作用[1-2]。最近研究发现P21活化激酶6（p21-activated kinase 6，PAK6）在肝癌和前列腺癌组织中高表达[3-4]，但是目前尚缺乏PAK6在结肠癌组织中的研究。本实验旨在观察PAK6表达与结肠癌患者临床特点及预后的关系。

1 材料与方法

1.1一般资料

随机抽取2007年1月-2010年12月福建省漳州市医院普外科手术腊块标本库中94例结肠癌患者的癌组织和相应的正常结肠上皮组织。所有标本收集术前均获得患者同意并获得福建省漳州市医院医学伦理委员会批准。94例结肠癌患者中，女51例（54.26%），男43例（45.74%）；年龄35～88岁（中位年龄61岁）。美国癌症联合委员会(AJCC)分期Ⅰ期患者20例（21.28%），Ⅱ期患者30例（31.91%），Ⅲ期患者30例（31.91%），Ⅳ期患者14例（14.89%）。所有病例均达到肉眼下根治，并行术野的淋巴结清扫。所有病例术前均未行放、化疗等抗肿瘤治疗。随访间隔按照国际抗癌联盟标准，为术后1～2年每3个月1次，第3年起每半年1次，第5年后每年1次。本研究随访截至时间为2014年6月1日。随访率为92.55%。

1.2RNA提取及cDNA合成

应用Trizol试剂盒（BBI公司，加拿大）随机抽取25对组织标本抽提总RNA。用紫外分光光度计检测RNA的浓度，根据在260和280 nm处的吸光度值，检测RNA的纯度，并经琼脂糖凝胶电泳验证RNA的质量。采用Fermentas（加拿大Fermentas公司）逆转录试剂盒以Oligo（dT）15为引物，由total RNA的3’Poly（A）区域引导出cDNA，反应条件：25℃5 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）

以cDNA产物为模版，以β-actin为内参，设计并合成聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)引物，依据SYBR Green qPCR Master Mix（加拿大Fermentas公司）进行Real-time PCR反应。引物序列：PAK6，正向引物：5'-ATCTGGGAGAGAAGG CGAAC-3'；反向引物：5'-GGAGGACAAGGAGACAG CAG-3'；β-actin正向引物：5'-CTGGGACGACATGG AGAAAA-3'；反向引物:5'-AAGGAAGGCTGGAAGA GTGC-3'。qPCR反应条件：50℃2 min，95℃10 min，95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共进行40个循环后72℃延伸5 min。反应完成后，取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳[5]。

1.4免疫组织化学法

所有94对标本均经10%福尔马林固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、切片厚4～6μm，脱蜡，再水化。置于pH 6.0的柠檬酸缓冲液中行高压抗原修复后，3%双氧水（H2O2）封闭内源性过氧化物酶活性。一抗孵育[PAK6，1∶300，美国Abcam；细胞核增殖抗原（Ki67），1∶500，美国Abcam]，4℃冰箱湿盒内孵育过夜。滴加二抗（基因科技，GK500705），并置于37℃恒温箱内孵育30 min。显微镜下二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水至透明，中性树胶封片。用已知结肠癌切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作为阴性对照[6-7]。评分标准：着色强度评分（0分，无；1分，弱；2分，中；3分，强），免疫组化阳性细胞率评分（0分，＜5%；1分，5%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，＞75%），两者之和为该病例评分值，设定评分0～2为阴性，＞2为阳性。

1.5统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件分析，计量资料组间差异比较采用配对t检验和方差分析。计数资料采用χ2检验和Fisher精确检验，单因素生存分析用Kaplan-Meier法，用COX比例风险模型进行多因素生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1RNA抽提质量鉴定

经鉴定，最终所有样本RNA在A260/A280的比值均在1.8～2.0，表明提取的RNA无明显降解，达到所需纯度。

2.2实时定量PCR（qPCR）

肠癌组织和癌旁组织中PAK6 mRNA表达水平差异有统计学意义（P＜0.01），结肠癌组织中PAK6 mRNA明显增高，具体情况见表1、图1。

表1 结肠癌组织与癌旁组织PAK6 mRNA表达水平（±s）

组别例数PAK6 mRNA相对表达t值P值结肠癌组织250.4010±0.0784.0810.0006癌旁组织250.1190±0.027

2.3免疫组化结果

94例结肠癌肿瘤组织中PAK6阴性者33例，阳性者61例。PAK6在正常组织低表达10.64%（10/94），在肿瘤组织中高表达64.89%（61/94），与qPCR检测结果一致。PAK6表达与临床病理资料的联系见表2。PAK6在结肠癌组织中的表达水平与肿瘤分化程度、远处转移、AJCC分期及Ki67显著相关（P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤部位无显著相关（P＞0.05）。见图2。

2.4结肠癌组织中PAK6蛋白的表达与患者预后的关系

94例结肠癌患者的5年总体生存率为52.2%。根据PAK6蛋白表达程度相应地分成PAK6阳性组和PAK6阴性组，Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示PAK6阳性组结肠癌患者的5年无病生存率及5年总生存率分别为30.3%及33.9%，明显低于PAK6阴性表达组的87.9%、84.8%，两者间差异均有统计学意义（χ2=25.801，P＜0.01；χ2=20.807，P＜0.01，图3）。在COX多因素回归模型分析中，将患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤远处转移、分化、AJCC分期、PAK6表达水平及Ki67表达水平纳入其中，结果发现PAK6蛋白表达是结肠癌患者无病生存率（P＜0.001）和总体生存率（P=0.003）的独立预后因素（表3）。此外，AJCC分期和肿瘤远处转移也是结肠癌的独立预后因子（P＜0.001）。

3 讨论

肿瘤的发生发展是一个多基因、多阶段的演变过程，小GTP蛋白酶Rho，Rac，Ras和Cdc42在一些重要的肿瘤中起作用[8]。PAKs作为Rac和Cdc42的效应器，生物研究显示其通过促进细胞增殖、生存、运动和血管生成等肿瘤标记过程，在细胞恶性转化中起关键作用[9]。PAKs包含6个亚型（PAK1-6），基因PAK6位于15q14，编码75kDa的蛋白，含有能与Cdc42/Rac相互结合（CRID）的N端区域和C端激酶域，在哺乳动物多种癌症中呈过表达、扩增或高反应状态[10]。

自PAK6被发现以来，越来越多的研究集中于PAK6生物功能和作用机制。RNA印迹分析揭示PAK6在睾丸和前列腺组织中高表达[3]。PAK6可特异性直接抑制雄激素受体（androgen receptor，AR）的活性，进而抑制AR介导的转录过程[11]。此外，PAK6还可增强前列腺癌细胞对多西他赛的化疗敏感性及对放射线的敏感性[12-13]，据此推测PAK6在癌症的发展和治疗过程中可能起着重要作用。

该实验是首个报道PAK6高表达与结肠癌发生发展关系的研究。为了解PAK6在结肠癌组织中的表达情况，笔者随机抽取了25对结肠癌患者临床标本进行qPCR检测，结果发现PAK6在肿瘤组织的mRNA表达水平显著高于正常结肠癌组织（P＜0.01）。免疫组化显示PAK6在94例结肠癌肿瘤组织中高表达64.89%（61/94），正常组织中只有10.64%（10/94）PAK6阳性。这些结果提示PAK在转录和转录后水平都是高表达，支持其作为新的结肠癌诊断的指标。临床资料统计进一步分析显示PAK6的表达量与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化、Ki67表达量和肿瘤远处转移高度相关，这些相关性提示PAK6高表达会促进肿瘤的增殖和转移。进一步对94例结肠癌手术患者进行Kaplan-Meier单因素生存分析，显示PAK6阳性组患者5年无病生存率及总体生存率均明显低于PAK6阴性组，其与预后呈负相关；多因素COX回归模型分析发现PAK6表达是影响结肠癌预后相关的独立危险因素。

该研究结果初步揭示了PKA6蛋白的表达水平与结肠癌临床病理及预后的关系，提示PAK6可有助于判断结肠癌生存预后。由于样本量有限，PAK6对结肠癌的诊治意义有待于进一步探讨；相信，随着临床试验和生物药学研究的顺利进行，PAK6可能是监测肿瘤临床预后的有用指标。

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Expression and clinical significance of p21-activated kinase 6 in colon cancer

Fei WANG1,Jian-guo LI2,Qiao-bin WU1,Long DENG1,Jie LUO1,Zai-ye LI3
(1.Department of General Surgery;2.Department of Hepatobiliary,Pancreas and Spleen Surgery, Zhengxing Hospital,Zhangzhou,Fujian 363000,P.R.China;3.Xiangya School of Medicine,Central South University,Changsha,Hunan 410013,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of p21-activated kinase 6 and its clinical significance in colon cancer.【Methods】Use reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and quantitative real-time PCR(qPCR)to test the expression of PAK6 mRNA in 25 paired tissues of colon cancer,and use the method of immunohistochemistry to test the expression of PAK6 in 94 paired cancer tissues.【Results】The results of qPCR showed that the average expression value of PAK6 mRNA in colon cancer tissues is actually higher than the normal tissues(P＜0.01).Immunohistochemical detection of PAK6 among 94 paired specimens showed seldom expression in normal tissues which only occupies 10.64%,while it highly expressed among the cancer tissues which account for 64.89%.Increased PAK6 was significantly associated with advanced AJCC stage index,tumor histologic grade,Ki67 expression and distant metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier univariate survival analysis revealed that five-year disease-free survival and overall survival rate for patients with positive PAK6 expression were significantly lower than those with negative PAK6 expression(P＜0.01).Multivariate Cox regression analysis revealed that PAK6 expression was an independent prognostic factor in disease-free survival and overall survival for patients with colon cancer.【Conclusion】The expression of PAK6 in colon cancer is significantly increased,it is probably a prognostic marker for colon cancer.

colon cancer;PAK6;prognosis

R737.14

A

1005-8982（2015）28-0007-05

2015-05-10

李建国，E-mail：jjxln649@163.com