不同基因型耐药分析系统在HIV耐药预测中的应用

赫天一，关琪，王礼宁

(沈阳医学院附属中心医院 中心实验室，辽宁 沈阳 110024)



不同基因型耐药分析系统在HIV耐药预测中的应用

赫天一，关琪Δ，王礼宁

(沈阳医学院附属中心医院 中心实验室，辽宁 沈阳 110024)

随着高效抗逆转录病毒治疗的持续进行，部分人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者的体内出现大量耐药毒株，产生的耐药性导致治疗效果大幅下降甚至治疗失败。生物信息学平台的基因型耐药分析技术，是预测上述HIV耐药性的有力工具，决定抗病毒治疗的成败。本文从基因型耐药分析的原理、特点等角度出发，对目前国际上流行的主要HIV基因型耐药分析系统的优缺点以及基因型耐药预测的影响因素和改进措施等方面进行综述，以期为不同基因型耐药分析系统在我国的合理应用提供借鉴。

人类免疫缺陷病毒；基因型耐药；解释分析系统

目前经美国食品药品监督管理局(FDA)批准的抗HIV药物主要包括：核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs)[1]、蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitors，PIs)、融合抑制剂(fusion inhibitors，FIs)、整合酶抑制剂(integrase inhibitors，INs)[2]、协同受体抑制剂(co-receptor inhibitors,CRIs)等6大类30余种抗病毒药物(包括复合制剂)。临床上广泛采用的高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy, HAART，又称“鸡尾酒疗法”)，正是将上述不同种类的药物进行合理的混合，进而大幅提升病毒基因耐药屏障、降低耐药发生几率，提高治疗效果和成功率。不过随着抗病毒治疗的不断深入，HIV耐药毒株的出现越来越多，其在人群中的直接传播也越来越广泛，这给艾滋病的防控带来诸多困难。如能在治疗前以及治疗效果不佳时，及时进行耐药基因的检测，尽早发现耐药毒株，就可在第一时间调整治疗方案，获得更为理想的治疗效果[3]。在这一过程中，生物信息学平台的HIV基因型耐药分析技术正是完成上述任务不可或缺的有力工具。

1 常用的HIV-1基因型耐药分析系统介绍

1.1 常用HIV-1基因型耐药分析系统的种类、原理和特点 目前主流的HIV病毒基因型耐药分析系统，均是以已知的病毒与抗病毒药物相互作用的分子结构为基础，以病毒的耐药突变序列为切入点，利用基于规则的统计学算法创建的[4-5]。其中具有代表性的有如下3种[6]：ANRS[7]、HIV db[8]和REGA[9]。其工作原理是以靶向蛋白质中已知的耐药相关突变为基础，将HIV病毒库中已知的病毒序列信息与各治疗药物实际药敏结果相结合，经统计学多元回归分析后定性或半定量的预测样本病毒的药物敏感性。其中HIV db是将HIV-1的PR和RT基因区出现的每个耐药突变赋以一定分数，然后将与同种药品相关的突变得分累加即得到样本对此药物的耐药总评分，根据总评分确定耐药水平。这种方法的优点是能够分析亚型、次要耐药突变及氨基酸替换情况，可提供序列质量控制结果，还可提供特效药评估。由于该方法是通过各突变赋分后的累加结果来推测耐药程度的，所以缺点是不能准确评价各耐药突变组合情况对耐药的影响程度[10]。与HIV db不同，REGA和ANRS主要是以已知的HIV-1患者的耐药相关变异及它们之间的组合情况与抗病毒药物疗效之间的相关研究结果建立的数据库(包含特效药治疗下产生的突变以及体外药敏试验的结果)为依托，通过描述具体的突变模式来预测HIV的耐药水平。相较于HIV db而言，它们能够较好地评价耐药突变组合对耐药的影响。其中ANRS可评价多种药物及多种耐药突变组合的耐药程度，不足之处在于需要提交氨基酸序列进行分析而不是基因型耐药检测时直接获得的DNA序列，且不提供亚型、序列质控和氨基酸替换等分析结果。REGA相比于ANRS而言可提供更为详细的耐药突变组合分析结果，能够进行亚型分析，分析结果还可用来评估治疗出现耐药后对患者仍然有效的药物数量及后续治疗效果[9]。不过不足之处同ANRS相似，都需要将待测序列翻译成氨基酸后方能提交，且不提供序列相关分析。除了上述各自的优缺点以外，3种解释系统对耐药程度的划分标准也不尽相同。其中HIV db一般将耐药程度划分为以下5个区间：敏感(0～9分)；潜在性低度耐药(10～14分)；低度耐药(15～29分)；中度耐药(30～59分)；高度耐药(>60分)。ANRS和REGA的划分标准相对简洁，只包括3类：敏感(1)；中度耐药(0.5)；耐药(0)。

1.2 其他HIV-1基因型耐药预测方法 除上述3种常用的基因型耐药分析系统外，人们还常利用统计回归方法，在短时间内推测出某种序列未知病毒的药物敏感性，精确度可达70%以上。相较其他方法而言统计回归方法也更具客观性[10]。VGI 8.0[11](Visible Genetics 8.0)也是目前较为流行的基因型耐药分析系统，它是由德国拜耳医药保健有限公司(Bayer Health Care-Diagnostics)研发的HIV-1耐药分析系统。其原理类似于ANRS和REGA，也是根据已经报道的耐药相关变异的种类及其组合情况，通过描述具体的突变模式来进行耐药水平的预测。此外，群体测序为基础的基因型耐药检测方法，包括VIROSEQTM和TRUGENETM也得到了广泛应用。它们与其他检测系统的主要区别在于他们不是单纯的基因型耐药检测系统，而是HIV基因型耐药检测系统和分析系统的综合体。在检测结果上，VIROSEQTM和TRUGENETM与HIV db在检测耐药相关突变位点上略有差异，尤其是在检测混合碱基时，VIROSEQTM和TRUGENETM的结果更加保守，这与2者更新周期较长，无法检测到最新耐药突变位点有关。而HIV db则是实时更新的，敏感性更高[12]。群体测序为基础的基因型耐药检测方法，检测所获信息量大，而且检测成本相对低廉，易于为一般患者所接受。以上基因型耐药检测系统对HIV-1 B亚型检测效果良好，针对其他非B亚型较不敏感，限制了其在欧美之外资源有限地区的应用和推广[12]。

2 常用HIV-1基因型耐药分析系统对耐药结果的预测

2.1 亚型依赖的HIV耐药突变模式对耐药预测的影响 针对于CRF01-AE病毒的研究结果显示，与B亚型相比其具有特异的逆转录酶突变65R和115M等，这种突变的存在直接导致了各分析系统间检测结果的差异程度远大于B亚型。即使在相同的耐药分析系统处理下，非B亚型也会产生出与B亚型不同的特异性突变类型[13]。不过，不同分析系统所获得的耐药分数大体上是相近的，少数差别较大的结果可能是由于某些特定亚型病毒具有的特异耐药突变组合(即亚型依赖的特异耐药位点突变模式)所致[14]。目前关于亚型依赖的病毒具体应答方式尚不清楚，但研究发现对于许多治疗过的患者来说都存在亚型依赖的突变位点，且数目远高于初次治疗的患者。但总的来说，非B亚型和B亚型具有数量相当的耐药突变，且2者差别在于野生型序列。因此推测，导致这一现象的原因在于野生型序列的固有差异[15]。

2.2 不同HIV-1基因型耐药分析系统对耐药结果预测的一致性 比较研究发现，3个耐药分析系统(HIV db、ANRS、REGA)对HIV病毒耐药的评估结果存在差异。但总的来说，不同系统所获得的耐药分数(耐药评价指标)并没有很大的差别。最一致的结果出现在NNRTIs类药物的耐药预测上，其次为PIs，一致性最差的是NRTIs。而且随着患病人数和治疗人数的不断增加，这种不一致性还会随之增加[11]。产生这种现象的原因可能是NRTIs类耐药突变比NNRTIs具有更为复杂的耐药突变模式以及突变间存在复杂的相互作用和组合形式。Snoeck J等[11]利用包括HIV db、ANRS、REGA、VGI 8.0在内的4种不同的分析系统对非B亚型毒株进行了耐药分析。结果发现，在接受治疗和尚未接受治疗的患者中都存在针对不同治疗药物的亚型依赖耐药突变。不同分析系统在未治疗组中预测的一致性较高，而在治疗组中一致性相对较低[16]。由于各解释系统在原理、数据库、特性等方面都存在差异，因此4种算法间存在预测不一致也是必然的，因为它们解释复合突变模式的方法存在本质上的不同[11]。在NNRTIs治疗中，尽管在已经报道的耐药病例中存在一些药物治疗后不同的耐药突变位点，但并没有发现任何亚型依赖的耐药分数不一致的情况。对于NRTIs，只在初治患者中一致性较好，而且C亚型的一致性要比B亚型高一些。上述现象的发生可能是B亚型序列更为频繁的发生逆转录酶区215位突变所致[17]。除此以外，周海卫等[18-19]还比对了Stanford HIV db和ViroSeq V2.8 2种系统对我国使用的11种HIV-1抗病毒药物耐药解释的一致性，发现2者具有较好的一致性，差异主要表现在后者的耐药判定较前者更为保守，这可能与其在参考临床数据时更为谨慎有关。Houssaini A等[9]对于病毒载量大于500拷贝/mL的1453例HIV患者进行了分析，比较了ANRS、REGA、LDVD和HIV db 4种解释方法在解释抗病毒药物-地达诺新耐药上的差异，结果发现对所有样本来说，ANRS和REGA 2者预测的一致性较好，而与HIV db间存在差别；此外，前3种方法预测的精确度要高于HIV db。

2.3 提高常用HIV-1基因型耐药分析系统预测精度的措施 Shen L等[20]在使用REGA解释系统对基因型耐药结果进行解释的过程中加入了药效这一加权因子，并尝试对解释系统中抗逆转录酶药物的相对效力进行适当纠正，发现相对于没有加权的解释系统来说，这些使用了校正因子的REGA解释系统大大提高了预测的精确度。随后Stürmer M等[21]又将这种方法应用于ANRS系统中，预测的精确度也同样得到了提升。上述结果显示，在HIV耐药解释系统中，对药效进行加权处理是提升预测精度、降低不同系统间矛盾的一种有效手段。除此之外，Prosperi MC等[22]在利用HIV db, ANRS和REGA解释分析系统对HIV-1基因型耐药进行预测时发现，如果将患者的相关辅助信息(如患者的人口学特征；病史；治疗史以及患者感染病毒的基因类型等)加入到逻辑回归模型中，将大大提高耐药预测的准确性。Choi JY等[23]也证实，增加基因型耐药数据库中人口统计学特征和病毒特征，可以大大提升解释说明系统对于HIV耐药的预测精度。

下一代测序NGS(next-generation sequen，NGS)可检出频率1%以下的耐药突变，这些基线低频的耐药相关突变是导致HAART治疗失败的主要原因。不过其复杂和繁琐的生物信息学处理过程，阻碍了它在常规检测中的应用。Garcia-Diaz等[24]将一种能够自动化分析和解释下一代测序结果的软件DeepChek与该技术相结合，实现了简便、快捷的结果分析和解释，并证实下一代测序技术能够提高核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂相关耐药突变的检出几率，进而提高HIV-1基因型耐药分析系统的预测精度。

3 结语

综上所述，利用基因型耐药分析技术对HIV的耐药情况进行检测与分析[25]，不仅在很大程度上降低了艾滋病治疗失败的风险，为临床医生针对不同患者制定合理有效的治疗方案提供了科学的指导，而且为全球艾滋病毒的遗传变异和耐药进化研究提供了有价值的依据。不过，目前常用的基因型耐药分析系统在HIV基因型耐药预测的精确度、特异性和预测结果一致性等方面均存在提升的空间，加之非B亚型基因多态性与病毒耐药性的关系目前尚不很清楚，这些方面都需要科学家们进行进一步的深入研究。

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(编校：王俨俨)

Discordances between interpretation algorithms for genotypic resistance in prediction of human immunodeficiency virus resistance

HAO Tian-yi, GUAN QiΔ, WANG Li-ning

(Central Lab of the Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical Collage, Shenyang 110024, China)

As highly active anti-retroviral therapy continues, large numbers of drug-resistant strains appeared in human immunodeficiency virus (HIV) infectors, which always leads to a decline of treatment results or even a treatment failure.The genotypic resistance analysis technique of the bioinformatics is a powerful tool to forecast the HIV resistance and also determines the success or failure of antiviral therapy.This review will be focus on the advantages and disadvantages, influence factor of the genotype resistance prediction and improve measure of the primary HIV drug resistance genotype interpretation system, depending on the principle and characteristics of the genotypic drug resistance analysis as the breakthrough point, in order to provide guidance for reasonable application of different genotypes drug resistance analysis system in China.

human immunodeficiency virus; genotypic resistance; interpretation analysis system

辽宁省自然科学基金(2013020210)；沈阳医学院科技基金(20142049；20123044)

赫天一，女，硕士，检验师，研究方向：感染性和遗传性疾病分子诊断，E-mail：candy_1004_candy@sina.com；关琪，通讯作者，男，博士，教授，主任检验师，研究方向：感染性和遗传性疾病分子诊断，E-mail：guanqi1231@sina.com。

R373.9

A

1005-1678(2015)07-0182-03