支气管肺泡灌洗液中β-联蛋白、转化生长因子β1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6在支气管肺发育不良中的表达及意义

杨敏， 李林瑞， 黄建宝， 孟燕妮， 陈艳萍

临床论著

支气管肺泡灌洗液中β-联蛋白、转化生长因子β1、Clara细胞分泌蛋白16、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6在支气管肺发育不良中的表达及意义

杨敏， 李林瑞， 黄建宝， 孟燕妮， 陈艳萍

目的 探讨β-联蛋白、转化生长因子β1(TGF-β1)、Clara细胞分泌蛋白16(cc16)、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6(KL-6)在支气管肺发育不良(BPD)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中的表达及其意义。方法 机械通气早产儿70例，其中40例诊断为BPD的患儿作为观察组，30例非BPD患儿作为对照组。采用酶联免疫吸附试验法检测两组患儿机械通气1、24、48、72 h BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平。结果 观察组平均胎龄及出生体质量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。随机械通气时间的延长，观察组cc16水平呈逐渐降低趋势，而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势，且48、72 h时均与1 h时各指标水平差异有统计学意义(P<0.01)。对照组TGF-β1、cc16于机械通气72 h时与1 h时水平差异有统计学意义(P<0.01)，而β-联蛋白、KL-6水平在各时间点的差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组机械通气各时间点β-联蛋白、TGF-β1水平均显著高于对照组各相应时间点指标水平,cc16显著低于对照组水平，差异有统计学意义(P<0.05)，而KL-6在机械通气48、72 h时高于对照组相应时间点，差异有统计学意义(P<0.05)，余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。各时间点比较，BPD中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05)，而cc16水平显著低于轻度组，差异有统计学意义(P<0.05)。多元逐步回归分析结果显示，机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素(P<0.01)。结论 机械通气早产儿BPD的发生与机械通气、吸氧时间的延长及低cc16水平密切相关，通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿BPD的发生提供预测依据。

支气管肺发育不良； β-联蛋白； 转化生长因子β1； Clara细胞分泌蛋白16； Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6； 婴儿，新生

早产儿多因急性呼吸窘迫需进行机械通气和氧疗，而随着机械通气和氧疗时间的延长往往易导致患儿肺损伤和支气管肺发育不良(bronchial pulmonary dysplasia，BPD)[1-2]。目前，BPD的病因及发病机制尚未阐明。有研究发现，Wnt/β-联蛋白信号通路、Ⅱ型肺泡细胞表面抗原6(Krebs Von den Lungen-6,KL-6)、Clara细胞分泌蛋白16(Clara cell secretory protein16, cc16)、转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)可能参与了肺组织损伤再修复、上皮细胞-间充质转化等过程[3]。因此，本研究动态监测机械通气BPD患儿支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平，并与非BPD患儿比较，旨在探讨其动态变化在BPD中的作用,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012-01/2013-12在湖南省儿童医院呼吸内二科住院行机械通气的早产儿70例，经阴道分娩24例，剖宫产46例。所有病例在产前均应用能量合剂、地塞米松治疗，促进胎儿生长及胎肺成熟。新生儿出生时由新生儿科和麻醉科医师在场，即刻进行Apger评分，胎龄评分及气管插管等急救措施。其中40例诊断为BPD的患儿作为观察组，其中男27例，女13例；经阴道分娩13例，剖宫产27例；肺透明膜病者19例，反复呼吸暂停者10例，新生儿肺炎者7例，窒息者4例；40例BPD患儿中轻度23例，中重度17例。另外30例非BPD患儿作为对照组，其中男21例，女9例；经阴道分娩11例，剖宫产19例；肺透明膜病者9例，反复呼吸暂停者9例，反复肺部感染者6例，窒息者6例。两组患儿在性别、分娩方式、疾病类型、窒息情况、感染情况方面比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准 BPD患儿均符合2001年美国国家儿童保健及人类发展研究院(NICHD)和心脏、肺及血液研究院(NHLBI)及罕见病委员会联合发布的诊断标准[4]。轻度BPD指出生后28 d需要氧疗，但纠正胎龄36周(或出生后56 d)不需要氧疗；中重度BPD指出生后28 d需要氧疗，纠正胎龄36周(或出生后56 d)仍然需要氧疗。

1.3 纳入标准 (1)进行机械通气的早产儿；(2)患儿家长同意并签署知情同意书，并通过本院伦理委员会批准。

1.4 排除标准 因严重肺部感染、窒息等抢救无效死亡者。

1.5 治疗方法 两组患儿均给予气管插管，并给予美国Infant Star 950型呼吸机进行机械通气。机械通气指征包括：存在呼吸窘迫综合征Ⅲ～Ⅳ级，或经吸氧治疗不能纠正的Ⅰ型或Ⅱ型呼吸衰竭，反复呼吸暂停等情况。根据患儿动脉血气情况动态调整呼吸机参数，维持目标：血氧饱和度≥0.85，pH值7.30～7.45，动脉血氧分压≥6.67 kPa，3.6 kPa≤动脉血二氧化碳分压≤5.5 kPa。若患儿原发疾病治愈或基本控制，全身情况良好，吸气峰压<0.196 kPa，通气频率降至10次/分，吸入氧浓度不超过40%，血气分析显示正常则可撤机。

1.6 指标检测 (1)BALF的收集：分别于通气后1、24、48、72 h将生理盐水温热后沿患儿气管插管滴入，每次约1 mL/kg，同时给予呼吸机给氧3～5次，迅速插入吸痰管直至碰到阻力，采用<6 kPa的负压吸引，在吸引同时退出吸痰管，整个操作需迅速完成，共进行2次操作，混合2次吸引的BALF，并记录体积，纱布滤过黏液后4 ℃离心15 min，取上清液，-80 ℃保存备用。整个操作均需严格无菌操作，并保持回路通畅，灌洗液温度适宜且操作精准。(2)相关指标检测：采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测两组患儿1、24、48、72 h不同时段BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6的表达水平。

2 结果

2.1 两组患儿一般资料比较 观察组平均胎龄及出生体质量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组患儿吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

注：与对照组比较，at=2.54，2.33，P<0.05；bt=11.20，13.46，P<0.01。

2.2 两组患儿相关指标比较 见表2。

注：与对照组相同时间点相比较，at=2.53，2.67，7.20，13.52,2.96，3.17，9.54，15.61,2.63，2.76，3.99，12.52,9.56，13.67，P<0.05；与本组1 h比较，bt=9.22,P<0.05，ct=5.12，11.22，7.86，13.22，2.76，5.83，17.64,P<0.01。

表2结果表明，随机械通气时间的延长，观察组cc16水平呈逐渐降低趋势，而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势，且48、72 h时均与1 h时各指标水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。对照组TGF-β1、cc16于机械通气72 h时与1 h时水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，而β-联蛋白、KL-6水平在各时间点间的差异均无统计学意义(P>0.05)。观察组机械通气各时间点β-联蛋白、TGF-β1水平均显著高于对照组各相应时间点指标水平,cc16显著低于对照组(P<0.05)，而KL-6在机械通气48、72 h时高于对照组相应时间点(P<0.05)，余时间点差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 轻度、中重度BPD患儿机械通气后不同时间点β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平的比较 见表3。

注：与轻度组相同时间点相比较，at=2.61，2.93，5.29，11.63，2.76，5.28，7.19，13.58，2.71，2.96，5.17，9.83，5.93，7.28，9.15，12.8,P<0.05。

表3结果表明，随机械通气时间的延长，轻度组及中重度组cc16水平均呈逐渐降低趋势，β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势，差异均有统计学意义(F=19.61、23.52、21.63、21.67，P<0.01)。各时间点比较，中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组，而cc16水平显著低于轻度组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4 BPD发生的多元回归分析 将患儿的胎龄、出生体质量、机械通气时间、吸氧时间及机械通气1 h时β-联蛋白、TGF-β1、cc16、KL-6水平进行多元逐步回归分析，结果显示，机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素(P<0.01)。见表3。

3 讨论

KL-6属Cluster 9的MUC-1类糖蛋白，主要由增殖或受损的AT-Ⅱ分泌，可以成为间接判断肺上皮损伤程度及再生的指标[5]。Clara水平细胞分布于终末细支气管和呼吸性细支气管上皮的非纤毛细胞，因此肺上皮衬液、BALF、血浆中cc16可作为反映Clara细胞及肺泡毛细血管膜完整性早期改变的敏感性指标[6]。有研究称在机械通气造成的炎性反应性肺损伤时，β-联蛋白过度表达，可进一步促进细胞周期蛋白D1转录，有助于创面的修复。而TGF-β1可促进细胞外基质形成，抑制酶解作用，促进新生血管的形成，趋化成纤维细胞，最终起到促纤维化的作用。研究发现，肺发育不良患者TGF-β1可发生过度表达，其可能通过直接抑制支气管上皮细胞的分化过程及影响肺表面活性蛋白的表达，导致肺囊泡数目形成减少而发挥作用[7]。动物实验发现，Wnt信号通路活化在整个鼠胚胎的发育过程发挥重要作用，β-联蛋白可表达于未分化的原始上皮、分化的肺泡上皮及相邻间质细胞等多种细胞的细胞质和细胞核，在肺发育过程中至关重要[6]。同时，低cc16水平也被认为是评估早产儿肺发育不良的重要标志物。

本研究结果显示，观察组BPD患儿机械通气后1 h BALF中β-联蛋白、TGF-β1明显高于对照组，cc16水平明显低于对照组，说明上述因子可能在BPD的发生及肺的发育成熟中起重要作用。因此通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿的肺发育程度及BPD的发生风险提供评估依据。

本研究结果还显示，观察组的吸氧时间及机械通气时间显著长于对照组，说明早产儿BPD的发生可能与吸氧及机械通气时间的延长有关。进一步回归分析示，机械通气时间、吸氧时间的延长及低cc16水平是BPD发生的危险因素。说明机械通气及吸氧本身可作为肺功能障碍的治疗措施，同时又是早产儿BPD发生的危险因素。由于早产儿肺发育尚未成熟，持续的机械通气可导致和增加肺部感染的概率及气道黏膜炎症，导致气道阻力及呼吸负荷增加，从而影响肺的发育，出现呼吸机依赖或撤机时间延长，最终导致早产儿BPD的发生。同时在机械通气状态下，肺组织可持续处于高氧状态，导致大量超氧化物和过氧化氢的产生，导致机体产生严重的氧化应激反应，但机体的抗氧化系统一般在妊娠最后3个月发育成熟，早产儿的抗氧化系统尚未成熟，极易受到自由基的损伤，因此在持续机械通气下出现气道上皮细胞大量死亡，肺泡数目减少，结构破坏，肺间质纤维化，最终发生BPD。

本研究结果显示，随时间延长，观察组cc16水平呈逐渐降低趋势，而β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平呈逐渐升高趋势，提示观察组患儿在机械通气48 h后即可能开始出现肺损伤，而对照组在72 h后可能出现轻微的肺损伤。因此机械通气是导致KL-6、β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平变化及BPD发生的重要因素。进一步比较不同BPD分级各指标水平，结果显示在各时间点比较，中重度组β-联蛋白、TGF-β1、KL-6水平均显著高于轻度组，而cc16水平显著低于轻度组。说明各指标水平的变化可在一定程度上反映BPD分级。因此通过动态监测机械通气患儿BALF中KL-6、β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对肺损伤的发生及程度进行预测及评估，尽早采取保护措施，尽可能减少BPD的发生。

综上所述，β-联蛋白、TGF-β1、cc16在早产儿BPD的发生机制中有重要作用，而KL-6可反映肺上皮的损伤程度。通过监测早产儿初始机械通气BALF中β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平可对早产儿BPD的发生提供预测依据。然而本文未对β-联蛋白、TGF-β1、cc16水平与BPD分度的关系进行探讨，有待进一步研究。

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(本文编辑：刘颖)

The expression and significance of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16(cc16) and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchialveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD)

YANGMin，LILinrui，HUANGJianbao，MENGYanni，CHENYanping.

TheSecondDepartmentofRespirationofHunanProvinceChildren'sHospital，Changsha410011，China.

Objective To investigate the expression of β-Catenin，transforming growth factor beta 1(TGF-beta 1), Clara cell secretory protein 16 (cc16), and surface antigen 6 of alveolar epithelial cell Ⅱ(KL-6) in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) of children with bronchial pulmonary dysplasia(BPD) and its significance.Method Of 70 cases of premature infants with mechanical ventilation, 40 cases diagnosed with BPD were included in observation group, 30 cases of non-BPD patients were as control group. Detect the levels of β-Catenin, TGF-beta 1, cc16 and KL-6 in BALF of two groups of children respectively after 1, 24, 48 and 72 h of mechanical ventilation using enzyme-linked immunosorbent assay method. Result Average gestational age and birth body mass of observation group were significantly lower than those of the control group, the difference being statistically significant (P<0.05).The time of mechanical ventilation and oxygen therapy were significantly longer than the control group, the difference being statistically significant(P<0.01). With longer duration of mechanical ventilation, the levels of cc16 of observation group showed a downward trend, and β-Catenin, TGF-beta 1 and KL-6 levels showed an upward trend, and the level difference of each index in time point of 48 and 72 h was statistically significant compared with that of 1 h(P<0.01). The difference of the level of TGF-beta 1 and cc16 of control group at time point 1 h and 72 h of mechanical ventilation was statistically significant (P<0.01), but the differences of level of beta protein and KL-6 at various time points had no statistical significance (P>0.05). Index levels of β-Catenin and TGF-beta 1 of observation group with mechanical ventilation at each time point were significantly higher than control group in the corresponding time point, but cc16 was significantly lower than the control group, the difference being statistically significant (P<0.05), while the KL-6 of observation group was higher than the control group in the corresponding time point of 48 and 72 h, the difference being statistically significant(P<0.05).There was no statistically significant difference at other time points(P>0.05). Comparing each time point,β-catenin, TGF-β1and KL-6 levels in the moderate and severe BPD group were significantly higher than mild group (P<0.05), but cc16 level was significantly lower than mild group (P<0.05). Multiple stepwise regression analysis results showed that the longer duration of mechanical ventilation time and oxygen and the low cc16 levels are a risk factor for the occurrence of BPD(P<0.01).Conclusion The occurrence of premature BPD is closely related to longer duration of mechanical ventilation and oxygen and low cc16 levels. Monitoring the level of β-Catenin, TGF-beta 1 and cc16 of BALF of premature infants in initial mechanical ventilation can provide the basis for predicting the occurrence of premature BPD and its classification.

bronchial pulmonary dysplasia； β-Catenin； transforming growth factor beta 1； Clara cell secretory protein 16； Krebs Von den Lungen-6； infant，newborn

湖南省科技计划项目(2012SK3256)

410011 长沙，湖南省儿童医院呼吸内二科

杨敏(1982-)，女，医学硕士，主治医师。研究方向：小儿呼吸系统疾病的临床诊治。

陈艳萍，410011 长沙，湖南省儿童医院呼吸内二科。

10.3969/j.issn.1674-3865.2015.03.008

R563.1+2

A

1674-3865(2015)03-0219-05

2015-04-10)