异氟烷宫内暴露对胎鼠海马神经元凋亡的影响

刘志强　徐振东　沈富毅　张玥琪　李海冰

(同济大学附属第一妇婴保健院麻醉科，上海　200040)

·论著·

异氟烷宫内暴露对胎鼠海马神经元凋亡的影响

刘志强徐振东沈富毅张玥琪李海冰

(同济大学附属第一妇婴保健院麻醉科，上海200040)

摘要目的：观察异氟烷宫内暴露对胎鼠海马神经元凋亡的影响。方法： 将妊娠19 d的SD大鼠随机分为异氟烷麻醉组(I组)和对照组(C组)，I组孕鼠接受3 h的1.3%异氟烷吸入麻醉，C组吸入空气。采用原位末端标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)观察胎鼠大脑海马CA1区神经元在异氟烷暴露结束后0、3 h和9 h时间点的凋亡情况。结果： I组和C组海马CA1区神经元在异氟烷暴露后0、3 h和9 h均见凋亡；2组异氟烷暴露后0 h和3 h凋亡指数差异均有统计学意义(P<0.05)，暴露后9 h凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05)。结论： 1.3%异氟烷宫内暴露不会加重胎鼠海马CA1区神经元的凋亡，在暴露后早期反而有减缓作用，提示胎儿期可能不是异氟烷发育神经毒性的易损期。

关键词异氟烷；宫内暴露；凋亡；海马神经元

中图分类号R329.2+5

文献标识码A

Effect of In-Utero Exposure to Isoflurane on Apoptosis of Hippocampal Neuron in Fetal RatsLIUZhiqiangXUZhendongSHENFuyiZHANGYueqiLIHaibing

DepartmentofAnesthesiology,ShanghaiFirstMaternityandInfantHospital,TongjiUniversity,Shanghai200040,China

AbstractObjective： To observe the effect of in-utero exposure to isoflurane on apoptosis of hippocampal neuron in fetal rats. Methods： SD rats at gestational day 19 were randomly assigned into the isoflurane anesthesia group(group I) and the control group(group C). The rats in group I were exposed to 1.3% isoflurane for 3 h,while group C were exposed to air. The Apoptosis status of neurons in hippocampal CA1 region of fetal brains were observed by using TdT mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) 0 h,3 h, and 9 h after exposure to isoflurane. Results： There were a certain amount of apoptotic neurons in hippocampal CA1 region in both group I and group C 0 h,3 h,and 9 h after the exposure.There were significant differences regarding apoptosis index(AI) 0 h and 3 h after the exposure between the two groups (P<0.05). However, there was no significant difference regarding the AI between the two groups 9 h after the exposure (P>0.05). Conclusions： The in-utero exposure to 1.3% isoflurane does not increase the apoptosis of neurons in hippocampal CA1 region of fetal rats. Furthermore, it may alleviate the apoptosis during the early period.The result suggests that fetus period may not be the vulnerable period for isoflurane-induced neurotoxicity.

Key WordsIsoflurane；In-utero exposure；Apoptosis；Hippocampal neuron

研究[1]发现，麻醉药可导致幼年动物大脑神经元过量凋亡，干扰突触的发育和塑形，影响神经元细胞骨架的正常形成及神经胶质细胞的发育和成熟等，并可能造成持续至成年阶段的神经认知能力削弱。与出生后的幼年动物接受全身麻醉不同，胎儿大脑处于发育的更早期，在其未脱离母体环境的情况下受到全身麻醉药的暴露是否会引发上述改变值得探究。本研究通过使孕鼠吸入异氟烷造成胎鼠大脑的宫内暴露，观察胎鼠海马CA1区神经元不同时间点的凋亡状况，以明确以异氟烷为代表的全身麻醉药对胎儿期大脑组织形态的影响，为进一步了解其对中枢神经系统发育期学习记忆能力的影响及机制提供依据。

1资料与方法

1.1实验动物及分组清洁级健康成年SD大鼠，16周龄左右，体质量(250±50)g，由华东师范大学脑功能基因组学研究所动物实验中心提供。大鼠实验前笼内适应性喂养1周，将发情雌鼠与雄鼠按 2∶1 比例合笼，观察到阴栓即为妊娠第1天并记录。选取18只孕鼠，于妊娠第19天开始进行实验，随机分为异氟烷组(I组)和对照组(C组)，每组各9只。

1.2试剂异氟烷由美国雅培公司产品生产；原位末端标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)凋亡检测试剂盒由瑞士罗氏公司生产。IMS细胞图像分析系统由上海基尔顿生物科技有限公司提供。其余实验试剂均由同济大学附属第一妇婴保健院中心实验室配制。

1.3方法孕鼠麻醉过程在自制麻醉箱中进行，术前禁食6 h，不禁水。麻醉期间保持麻醉箱内温度在37～38 ℃。以氧气作为载气，使异氟烷通过麻醉挥发罐后进入箱内。待异氟烷达到预定浓度1.3%后，将鼠放置于麻醉箱上部隔板上。待其被麻醉，快速将婴儿脉搏血氧饱和度(saturation of pulse oxygen，SpO2)带状探头环绕于孕鼠腹部，持续监测SpO2。气体取样接头处接麻醉监护仪，监测箱内麻醉气体浓度、氧浓度和二氧化碳浓度。调整氧流量，维持吸入氧浓度30%。调整挥发罐刻度和氧气流量，维持异氟烷浓度于1.3%，持续吸入3 h。麻醉过程中，注意观察孕鼠皮肤颜色和呼吸情况，间断予以翻身，保持孕鼠SpO2>90%。C组孕鼠置于同型麻醉箱内，吸入空气，时间同为3 h。

1.4标本的采集和处理2组孕鼠接受异氟烷麻醉或空气吸入后，在暴露结束后0 h(麻醉结束即刻)、3 h和9 h 3个时间点，各随机选取3只孕鼠，腹腔注射苯巴比妥(100 mg/kg)麻醉后立即剖宫产。从每只孕鼠子宫中随机取出体质量均匀的胎鼠2只(各时间点每组共6只)。将胎鼠迅速移至超净台冰盒上，解剖镜下暴露心脏，左心室经4 ℃ 0.9%氯化钠液、4%多聚甲醛慢灌注固定。随后，迅速分离出大脑海马组织，于4℃下置入4%多聚甲醛内固定12 h，再置入50%乙醇中浸泡4～5 h，常规石蜡包埋，作连续冠状切片(5 μm)备用。抽取2组暴露后0 h孕鼠的左心室血液100 μL，备做动脉血气和血糖检测。

1.5TUNEL法检测海马神经元凋亡严格按照TUNEL试剂盒说明书操作，每只胎鼠取3张切片，于高倍镜下(×400)选取海马CA1区神经元6个视野摄影，使用IMS细胞图像分析系统进行分析，读取凋亡细胞数，取平均值并计算凋亡指数(apoptosis index，AI)。TUNEL凋亡细胞为散在分布、染色不均匀、细胞核中有棕黄色颗粒者。AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

2结果

2.1孕鼠动脉血气分析及血糖结果异氟烷麻醉暴露期间全部孕鼠未出现明显呼吸停止、缺氧、二氧化碳蓄积等改变。2组孕鼠暴露后0 h动脉血pH值、动脉氧分压、动脉二氧化碳分压及血糖等差异均无统计学意义(P>0.05)，均大致正常，可排除由于麻醉引起的母体低氧、低血糖等不良反应导致胎鼠的神经系统损害，见表1。

2.2TUNEL染色和AI结果在暴露结束后的各时间点2组胎鼠的海马CA1区均见一定数量的凋亡细胞，见图1。Ⅰ 组在暴露后0 h和3 h AI明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，2组暴露后9 h AI差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

A：C组暴露后0 h；B：C组暴露后3 h；C：C组暴露后9 h；D：I组暴露后0 h；E：I组暴露后3 h；F：I组暴露后9 h

图12组孕鼠宫内暴露后不同时间点胎鼠海马CA1区神经元的凋亡情况(TUNEL法，×400)

与C组同时间点比较，*P<0.05

图22组孕鼠宫内暴露后不同时间点胎鼠海马

CA1区神经元凋亡指数(AI)比较

3讨论

1.3%异氟烷吸入浓度被认为是孕鼠的最低肺泡气浓度(比人类略低)，吸入该浓度的异氟烷可对孕鼠产生全身麻醉作用，并且母体与胎鼠的脑内浓度基本一致[2]。

Jevtovic-Todorovic等[3]首次发现以异氟烷为代表的全身麻醉药会造成幼年动物大脑神经元的过度凋亡，造成神经元密度减少和认知功能减弱，而啮齿类新生动物对这种神经退化作用特别敏感。后续的研究[4]证实，全身麻醉药可以引起包括灵长目动物在内的发育期动物大脑的神经退行性改变，甚至导致动物持续至成年后的神经认知功能障碍。在现有全身麻醉药引发非成熟动物脑毒性的研究基础上，本研究将全身麻醉药用于大脑发育的更早期——胎儿期，但结果显示，异氟烷宫内暴露没有加重胚胎期大鼠海马神经元的凋亡，反而在麻醉早期表现出一定的减缓作用，说明全身麻醉药的暴露对此阶段的非成熟大脑不产生明显的神经退化作用。

结合全身麻醉药引起发育神经元凋亡的机制和宫内暴露的特殊性，本研究采用1.3%异氟烷宫内暴露未产生明显神经退化的原因如下：(1)胎儿期可能未处于全身麻醉药毒性的易损期内。大脑神经元表面受体功能的发育具有阶段特异性，研究[5]发现，异氟烷引起凋亡的发育神经元为谷氨酸能、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)能和多巴胺能神经元，毒性作用可能是全身麻醉相关的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受体和GABA受体功能由兴奋性向抑制性转换不一致引起的。在鼠脑的发育过程中，出生后7 d鼠脑的NMDA受体才具有极高的敏感性，此时应用全身麻醉药如异氟烷，会显著抑制NMDA受体或激活GABA受体，引起内外源凋亡途径的激活，导致过量神经元凋亡，故此期被视作是全身麻醉药发育神经毒性的易损期。现有的全身麻醉药发育神经毒性的研究大多选择于此阶段实施。但胎鼠与出生后的幼鼠不同，其脑内NMDA受体还没有发育，或此阶段GABA受体功能尚不能完全发挥作用，全身麻醉药或因不能结合相应的功能性受体而使毒性作用减弱，故胎儿期阶段的大脑对全身麻醉药的神经毒性不敏感。(2)异氟烷的发育神经毒性具有剂量(浓度)依赖性，过高浓度和较长持续时间方可造成大脑神经元的损害，如使用3%的异氟烷或大于4 h的干预时间才能明显增加胎鼠脑神经元的凋亡[6-7]，在没有达到毒性浓度和时间下，异氟烷可以通过降低脑代谢率、减缓能量消耗、减轻细胞钙超载、抑制兴奋性氨基酸释放及产生抗氧化等作用，表现出一定的神经保护作用。(3)宫内环境中母体雌激素、孕激素产生的脑保护作用不容忽视。比如雌激素可调节脑血管功能、促发一氧化氮形成、拮抗兴奋性毒性等，孕激素也具有稳定神经元膜、减轻脂质过氧化反应、抑制神经元过度兴奋等作用，从而产生积极的神经保护。与出生后的幼鼠缺乏足够的雌、孕激素水平相比，胎鼠在宫内获得母体高水平雌、孕激素的脑保护作用，这可能也是避免其发育神经元过度凋亡的原因。

参考文献

[1]Loepke AW,Soriano SG.An assessment of the effects of general anesthetics on developing brain structure and neurocognitive function[J].Anesth Analg,2008,106(6):1681-1170.

[2]Li Y,Liang G,Wang S,et al.Effects of fetal exposure to isoflurane on postnatal memory and learning in rats[J].Neuropharmacology,2007,53(8):942-950.

[3]Jevtovic-Todorovic V,Hartman RE,Izumi Y,et al.Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits[J].J Neurosci,2003,23(3):876-882.

[4]Stratmann G.Neurotoxicity of anesthetic drugs in the developing brain[J].Anesth Analg,2011,113(5):1170-1179.

[5]Zhou ZW,Shu Y,Li M,et al.The glutaminergic,GABAergic,dopaminergic but not cholinergic neurons are susceptible to anaesthesia-induced cell death in the rat developing brain[J].Neuroscience,2011,74:64-70.

[6]Wang S,Peretich K,Zhao Y,et al.Anesthesia-induced neurodegeneration in fetal rat brains[J].Pediatr Res,2009,66(4):435-440.

[7]Istaphanous GK,Howard J,Nan X,et al.Comparison of the neuroapoptotic properties of equipotent anesthetic concentrations of desflurane,isoflurane,or sevoflurane in neonatal mice[J].Anesthesiology,2011,114(3):578-587.

通讯作者刘志强，E-mail：drliuzhq@hotmail.com

基金项目：上海市科学技术委员会医学引导资助项目(编号：14411966700)；上海市卫生和计划生育委员会基金面上项目(编号：20124287)