MRI示踪超顺磁性氧化铁标记兔脂肪干细胞治疗关节软骨缺损的研究

刘锴　李春波　陈增淦　曾蒙苏　傅彩霞　陈财忠

(1. 复旦大学附属中山医院a放射科，b骨科，上海　200032；

2. 西门子(深圳)磁共振有限公司， 深圳　518057)

MRI示踪超顺磁性氧化铁标记兔脂肪干细胞治疗关节软骨缺损的研究

刘锴1a△李春波1b△陈增淦1b曾蒙苏1a傅彩霞2陈财忠1a

(1. 复旦大学附属中山医院a放射科，b骨科，上海200032；

2. 西门子(深圳)磁共振有限公司， 深圳518057)

摘要目的：利用磁共振成像技术动态监测超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)标记的兔脂肪干细胞(adipose-derived stemcells, ADSCs)在兔体内的变化及其对兔膝关节软骨缺损修复的进程。方法： 用不同浓度(0、12.5、25、50、100 μg/mL)的超顺SPIO标记ADSCs。采用普鲁士蓝染色法测定细胞的标记情况，并计算细胞标记率。用细胞计数试剂盒(CCK-8)测定不同浓度的SPIO对细胞活性的影响。将不同浓度SPIO标记的不同数量的ADSCs快速均匀地重悬于盛有1%琼脂糖的冷冻管中进行体外MRI成像，测量T2*图像信号强度。将50 μg/mL的SPIO标记的ADSCs接种至聚乳酸-羟基乙酸共聚酶[Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]支架材料后，回植入兔(n=5)膝关节软骨直径为3 mm的软骨缺损处，分别于术后1、4、8和12周进行MRI T2*序列动态扫描，监测干细胞在体内的变化及关节软骨的修复情况。结果： 原代培养的ADSCs呈成纤维细胞样外观，培养7 d后细胞呈聚集样生长。普鲁士蓝染色见细胞质内有明显的蓝色致密颗粒，随着SPIO浓度的升高，蓝色致密颗粒增多；当SPIO的浓度≥50 μg/mL时，细胞的标记率可达100%。CCK-8检测显示，SPIO的浓度越高，细胞的活性越低，当SPIO的浓度大于50 μg/mL时，细胞的活性明显降低(P<0.05)。体内MRI显示，术后1周和4周可见颗粒状低信号区域，信号强度明显低于对照组。术后8周，颗粒状低信号范围逐渐缩小，信号强度接近周围组织，说明SPIO标记的ADSCs在动物体内存活良好，并正常分裂增殖，形成正常关节软骨结构。结论： MRI联合SPIO可以动态监测细胞在体内的分布、生长和转归，有望作为一种动态监测组织工程修复关节软骨缺损效果的方法。

关键词磁共振；脂肪干细胞；超顺磁性氧化铁；细胞示踪

中图分类号R684

文献标识码A

MRI Tranking of Superparamagnetic Iron Oxide-Labeled Rabbit Adipose-Derived Stem Cells for Treatment of Carticular Carilage DefectLIUKai1a△LIChunbo1b△CHENZenggan1bZENGMengsu1aFUCaixia2CHENCaizhong1a

1.aDepartmentofRadiology,bDepartmentofOrthopedics,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 2.SiemensShenzhenMagneticResonanceLtd.,Shenzhen518057,China

AbstractObjective： To detect dynamically in vivo superparamagnetic iron oxide-labeled rabbit adipose-derived stem cells (ADSCs) for treatment of carticular cartilage defect with MRI tracking technique. Methods： Rabbit ADSCs were firstly labeled with different concentrations of SPIO (0 μg/mL,12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, and 100 μg/mL). The labeled ADSCs were stained with Prussian blue and the labeling rates were calculated. The activities of different concentration SPIO-labeled ADSCs were determined by CCK-8. Different amounts of different concentration SPIO-labeled ADSCs were dissolved homogeneously in cryovial with 1% agarose and T2*-weighted MRI was used to evaluate their signal intensity in vitro. Then 50 μg/mL SPIO-labeled ADSCs and unlabeled ADSCs were seeded in PLGA [Poly (lactic-co-glycolic acid)] scaffold, respectively. Following that, the cells-PLGA scaffold compounds were implanted in the rabbit (n=5) articular cartilage defect with average diameter 3 mm. At 1, 4, 8, and 12 weeks post-operatively, the change of implanted-ADSCs and the repain of articular cartilage defect were dynamically detected by T2*-weighted MRI. Results： Primarily cultured rabbit ADSCs presented fibroblast-like appearance, and ADSCs proliferated with aggregations after 7 days. Prussian blue staining showed amount of blue dense granules in cytoplasm. With the increasing of SPIO concentration, the count and region of blue dense granules increased. When SPIO concentration reached 50 μg/mL, the labeling rate of ADSCs reached 100%. The measure of CCK-8 showed that the activities of ADSCs decreased with the increasing of SPIO concentration. When the SPIO concentration was greater than 50 μg/mL, the activities of ADSCs were obvious low (P<0.05). In vivo, MRI showed postoperative 1 week and 4 weeks visible granules with low signal area, and the signal strength was significantly lower than the control group. Until 8 weeks post-surgery, granules with low signal area gradually narrowed and signal strength was similar to the control group. SPIO-labeled ADSCs lived with a normal division growth and performed normal cartilage articular. Conclusions： MRI combined SPIO is a potential method to dynamically detect the distribution, growth and prognosis of cells in the body, and can also be used to determine the respiration of articular cartilage defect.

Key WordsMagnetic resonance imaging；Adipose-derived stem cells;Superparamanetic iron;Cell tracking

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是一类来源于脂肪组织、具有自我更新及多向分化能力的成体间充质干细胞。在特定的诱导条件下培养，ADSCs可以向心肌细胞、骨细胞、神经元和软骨细胞等终末细胞分化，在疾病治疗和再生医学方面具有潜在的研究及应用价值[1-5]。近年来，干细胞移植技术的研究主要集中于干细胞植入机体后的细胞分布、分化、增殖及转归等生物学行为。但是，如何无创地监测植入细胞在机体内的生存迁徙情况一直困扰着临床。超顺磁性氧化铁颗粒(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是一类MRI阴性对比剂[6-7]，它的有效成分是Fe3O4晶体核心，被包以葡聚糖生物高分子物质，构成核壳结构。包覆后的SPIO具有一定的超顺磁性，能明显缩短组织的T2值。本研究通过对兔ADSCs进行不同浓度的SPIO标记，研究SPIO对干细胞的生物学行为的影响，并观察特定浓度SPIO的体外和体内MRI成像效果，为干细胞的广泛应用奠定基础。

1资料与方法

1.1材料成年新西兰大白兔10只，体质量约1.8 kg(购自复旦大学附属中山医院实验动物中心)。DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自澳大利亚JRH公司；L-谷氨酰胺(300 g/mL)、SPIO、 胰蛋白酶、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)PLGA]支架材料购自上海实生细胞生物技术有限公司；抗坏血酸(50 g/mL)、氯仿、氯化钠购自国药集团上海化学试剂有限公司；青霉素(0.062 5 g/L)、链霉素 (100 g/L)购自石家庄华北制药有限公司；I型胶原酶购自美国sigma公司。

1.2兔ADSCs的分离和培养ADSCs的培养参照我们以往的研究[8]，具体步骤为：成年大白兔麻醉后，取腹股沟处皮下脂肪组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍，将脂肪组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的颗粒，置于相等体积、质量分数为0.075%的I型胶原酶中，37℃恒温搅拌消化60 min。取等体积的基础培养基(低糖DMEM、10% FBS、100 g/L链霉素、0.062 5 g/L青霉素)中和后，重新悬浮并离心(2000 r/min，10 min)。弃去上层的脂肪细胞、脂滴和液体，加入基础培养基重悬细胞，将混悬液体加入培养皿，置于37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的培养箱培养，2～3 d换液1次，待细胞生长融合达80%～90%时，用胰蛋白酶消化传代备用。

1.3SPIO标记ADSCs将经高温灭菌处理的SPIO加入基础培养基中，配成浓度分别为100、50、25和12.5 μg/mL的SPIO混合液，未加入SPIO的培养基定义为 0 μg/mL。待上述第三代ADSCs长至培养皿底面积的85%时，弃去原培养基，PBS充分冲洗2次后，加入含不同浓度SPIO的培养基。将培养皿置于培养箱孵育24 h后，弃去培养基，PBS冲洗3次，加入未标记的基础培养基。

1.4普鲁士蓝染色及标记率计算选择不同浓度SPIO标记的ADSCs，弃去原培养基，无菌PBS冲洗3次，加入4%的多聚甲醛溶液固定15 min，水洗3次。加入普鲁士蓝(2% 亚铁氢化钾和2% 盐酸的体积比为1∶1)孵育30 min，水洗。在倒置显微镜下观察并拍照，计算铁染阳性率。

1.5不同浓度SPIO对ADSCs生物活性影响的检测将ADSCs用基础培养基重悬后，以每孔3×103个细胞接种于96孔板。然后将板置于37℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱培养24 h。细胞标记参照上述方法，待细胞完全贴壁后，弃去原培养基，将含不同浓度SIPO的培养基分别加入不同的孔中，每组6孔。培养24 h后，弃去上清液，加入CCK-8试剂，每孔10 μL，混合均匀，于37℃恒温箱避光孵育2 h，用酶标仪检测波长450 nm处的荧光强度。将未标记的ADSCs作为对照，计算ADSCs的活性。

1.6标记细胞的体外MRI成像将各浓度SPIO标记的ADSCs快速均匀地重悬于盛有1%的琼脂糖的冷冻管中(细胞密度分别为1×107个/mL、0.5×107个/mL、1×106个/mL、0.5×106个/mL)，每组3个样本。待琼脂冷却凝固后，进行MRI扫描。应用3.0T MR机，实验专用线圈，采用梯度回波T2*序列。成像参数：扫描野(FOV)为120 mm×120 mm，重复时间(TR) 445.00 ms，回波时间(TE) 4.36 ms，矩阵256×256，层厚2 mm，层间距0.6 mm，翻转角60°，带宽 228Hz/像素， 激励次数2.0。测量每个样本的信号强度，根据信号强度确定不同SPIO浓度及细胞数量对T2*WI图像的影响。

1.7细胞支架材料复合物的制备细胞支架材料复合物的制备根据我们以前的方法[8]，具体制备步骤为：将第3～5代50 μg/mL SPIO标记的ADSCs用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化后，收集细胞于50 mL离心管，2000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入含10% FBS的DMEM培养液，计数，配制成1×107个/mL的细胞悬液，用微量移液枪将细胞接种于灭菌的PLGA支架材料。置于培养箱中培养4 h后添加基础培养基。24 h后，把细胞支架材料复合物移至6孔板。用同样的方法制备未标记的ADSCs支架材料复合物。

1.8兔膝关节软骨缺损模型的制备取健康西兰兔5只，将其放置于动物台上，用氯胺酮(1 mg/kg)经肌内注射麻醉后，固定、备皮、常规消毒铺巾。于膝关节内侧作纵行切口，逐层切开关节腔，将髌骨推向外侧，暴露双侧髌股的关节面(图1A)。于股骨滑车关节面处用直径为3 mm的钻头钻孔，造成软骨全层缺损(图1B)。完全去除组织碎屑和血块后暴露缺损，左肢植入SPIO标记的ADSCs支架材料复合物(实验组，n=5)，右肢植入未标记的ADSCs支架材料复合物(对照组，n=5)，见图1C。分层缝合膝关节囊、组织、皮肤。

A：充分暴露髌骨关节面；B：关节面正中以3 mm为直径钻孔，去除组织碎屑，充分暴露缺损；C：充分填充ADSC支架材料复合物

图1兔膝关节软骨缺损模型的制作过程

1.9标记细胞的体内MRI成像干细胞支架材料移植后第1、4、8和12周，分别行兔膝MRI检查。应用德国Siemens verio 3.0T超导磁共振扫描仪，8通道膝关节专用线圈。用前述方法将兔麻醉后取仰卧位，分别固定双前肢和双后肢行MRI成像，将膝关节缺损局部置于线圈中心部位。T2*序列：FOV为140 mm×140 mm，TR 445.00 ms，TE 4.36 ms，矩阵320×320，层厚2 mm，层间距0.4 mm,带宽228Hz/pixel，激励次数7.0； 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI TR 4500 ms，TE 100 ms，翻转角30°，激励次数2.0。

1.10统计学处理采用SPSS 19.0软件进行多样本方差分析，比较不同浓度SPIO对ADSCs的标记率及细胞活性的影响，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1兔ADSCs的形态观察ADSCs培养24 h后，可见散在少量的贴壁细胞，以短梭形细胞为主，部分呈三角形或不规则形(图2A)。72 h后，可见较多的梭形贴壁细胞，分裂增殖速度快，增生为形态相对均一的成纤维样梭形细胞。7 d后，80%～90%细胞融合，并呈束状、菊花状或旋涡状排列。传代至第3代，可见ADSCs呈长梭形，形态均一(图2B)。

A：原代ADSCs培养24 h后；B：第3代ADSCs培养72 h后

图2倒置显微镜观察ADSCs的形态

2.2SPIO标记ADSCs情况SPIO标记的ADSCs呈普鲁士蓝染色阳性，可见细胞内蓝色致密颗粒分布。随着SPIO浓度的增加，蓝色致密颗粒颜色加深。而未标记SPIO的ADSCs细胞质中未见蓝色颗粒物质。显微镜下观察蓝染ADSCs并计算阳性率。当SPIO的浓度≥50 μg/mL时，标记24 h后，阳性率几乎达100%(图3A～B)；当SPIO的浓度<50 μg/mL时，标记24 h后，随着SPIO浓度的降低，标记率也显著下降(图3C～E)。不同浓度SPIO对ADSCs的标记率见图4A。

A～E分别为100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和0 μg/mL的SPIO标记的ADSCs

图3普鲁士蓝染色显示SPIO标记的ADSCs

2.3SPIO对ADSCs生物活性的影响用CCK法检测不同浓度SPIO标记的ADSCs的活性。当SPIO的浓度为12.5、25、50 μg/mL时，与未标记SPIO(0 μg/mL)的ADSCs相比，活细胞率差异无统计学意义(P>0.05)。当SPIO的浓度为100 μg/mL时，活细胞率较SPIO浓度为50 μg/mL时显著减少。这些结果表明，低浓度的SPIO(≤50 μg/mL)对ADSCs的活性没有明显影响；但是当SPIO的浓度大于50 μg/mL时，细胞活性显著降低。见图4B。

注：与50 μg/mL 相比，*P<0.05； A：不同浓度SPIO的细胞标记率；B：不同浓度SPIO对ADSCs活性的影响

图4不同浓度SPIO的ADSCs标记率及

2.4SPIO标记ADSCs的体外信号特征不同浓度SPIO标记的ADSCs培养24 h后，在T2*加权MRI扫描图像上，可见SPIO的浓度及细胞的数量均会影响MRI信号强度。在SPIO浓度一定的条件下，随着细胞数量的增多，MRI信号强度逐渐减低；在细胞数量一定的条件下，随着SPIO浓度的增加，MRI信号强度逐渐减低。见图5。

A：T2*加权MRI图像；B：T2*序列MRI信号强度变化

图5不同浓度SPIO标记的不同数量ADSCs的体外信号强度变化对ADSCs活性的影响

2.5SPIO标记ADSCs的MRI体内成像关节软骨损伤模型制作成功后，实验组术后1周见关节软骨缺损处出现弥漫性颗粒状异常低信号改变；术后4 周见软骨缺损部位低信号范围扩大，但随着支架植入时间的延长，信号减低程度逐渐减轻；术后8周和12周软骨缺损处信号减低程度明显减弱，范围亦明显缩小，信号强度类似于周围组织。对照组于术后1周、4周、8周和12周未见信号强度的明显变化。见图6。

A1～A4：植入50 μg/mL SPIO标记的ADSCs支架材料复合物后，第1、4、8和12周MRI图像；B1～B4: 植入未标记SPIO的ADSCs支架材料复合物后，第1、4、8和12周的MRI图像；C：正常兔膝关节MRI图像；D：细胞支架材料植入体内后，MRI信号强度的变化

图6SPIO标记ADSCs修复兔关节软骨缺损的MRI体内成像

3讨论

软骨组织是由多糖和胶原组成的乏血管组织。软骨组织损伤修复的过程复杂，已是临床的难题之一。组织工程的出现为软骨损伤的修复提供了新的方法，其中，获得理想的种子细胞是其最核心的环节[1-3]。2004年，Zuk等[9]首次从脂肪组织中分离培养出具有多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。大量的研究证实了来自于脂肪组织的MSCs表现出与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)类似的增殖分化能力。体外培养的ADSCs在不同的诱导条件下，不但能够向脂肪、软骨、骨、肌肉等中胚层细胞系分化[5, 8-10]，而且能够向神经、内皮、心肌等其他胚层细胞系分化[11-13]。体外培养的ADSCs植入机体后能分化形成特定的组织，在组织损伤的修复与重建方面具有巨大的应用价值。但是，应用组织工程的方法重建组织缺损涉及到一个关键的问题，即如何动态地评估干细胞等移植物在活体中的存活、分布、迁移、转归等过程。目前，大多数用于鉴定干细胞体内存活的方法均需要在植入后的一定时间内处死实验动物。因此，探索一种有效的无创方法对植入的种子细胞进行动态追踪和监测，显得非常重要。本研究选择具有高度增殖及分化潜能的ADSCs来重建兔关节软骨的缺损，同时结合MRI技术来评估ADSCs在体内的生存、迁徙情况。

SPIO是一种由葡聚糖生物高分子包裹Fe3O4晶体形成的呈核壳式结构的磁标记探针，其可明显缩短MRI T2值，降低组织的信号强度[6-7]。当标记ADSCs时，细胞团可因吞噬铁颗粒而呈现明显的低信号，可以间接地反应移植物的分布及聚集情况[14]。本实验通过SPIO标记ADSCs来检测磁性材料对细胞的影响，结果显示，随着SPIO浓度的增加，细胞的标记率增高，当SPIO的浓度为50 μg/mL 时，细胞的标记率可达100%；但是随着SPIO浓度的增加，细胞的活性逐渐下降，坏死细胞的数量增多，SPIO浓度≤50 μg/mL时，对细胞活性的影响则不明显。Arbab等[15]的研究亦显示，浓度为25～50 μg/mL的SPIO对细胞的有效标记率最高，同时不影响细胞的生存、增殖能力及活性。体外MRI显示，标记细胞的SPIO浓度和细胞数量均会影响MRI的信号强度。当SPIO的浓度<25 μg/mL时，单纯增加细胞的数量不明显影响MRI的信号强度。我们推测，可能由于细胞的标记率太低，即使细胞的数量增加了，但是标记细胞的数量并没有明显增加，因此MRI信号强度不会随之改变。当SPIO的浓度为50 μg/mL和100 μg/mL时，随着细胞数量的增加，MRI信号强度明显减低。因此，我们认为，SPIO的浓度为50 μg/mL时，既可以获得较高的细胞标记率，同时不影响细胞活性，还可以产生随着细胞数量变化的MRI信号变化趋势，这对于评价细胞在体内的转归具有重要意义。

组织工程技术的不断进步为软骨损伤的修复重建开辟了一条新的途径[16]。本研究采用浓度为50 μg/mL的SPIO标记兔ADSCs，并种植于PLGA支架材料来修复兔的膝关节软骨缺损。MRI显示，实验组术后1周软骨缺损处出现明显的低信号影像；术后4周，低信号强度较前明显减弱，低信号范围明显缩小；术后8周和12周，低信号消失，信号强度类似于周围的软骨组织，说明植入ADSCs支架材料复合物可以修复兔的膝关节软骨缺损。但是植入未标记SPIO的ADSCs支架材料复合物的对照组的MRI 信号强度自术后1周到12周没有发生明显的变化。为了进一步评估ADSCs支架材料复合物的体内情况，我们定量测定了细胞支架材料的MRI信号强度，结果显示，实验组术后1周的MRI信号强度明显低于对照组和正常组；术后4周，实验组的信号强度逐渐升高，较术后1周差异有统计学意义(P<0.05)；术后8周，实验组的信号强度升高到接近对照组和正常组。ADSCs吞噬的SPIO在体内逐渐代谢，可能涉及以下两个方面：(1)由于ADSCs在体内的分裂增殖，子代中的总铁含量降低；(2)干细胞凋亡或裂解，游离的铁离子会被周围巨噬细胞吞噬。因此，局部干细胞SPIO产生的信号逐渐减弱。尽管这种代谢过程可能会影响MRI信号强度，而巨噬细胞吞噬磁性材料后游走、迁徙，在早期即可以改变MRI的信号强度，但对于干细胞的原位分裂、分化来说，这个过程相对缓慢。本研究证实，ADSCs支架材料复合物植入体内后，MRI的信号强度变化是一个逐渐减低的过程，8周后接近于对照组，说明ADSCs在体内增殖、分化良好，且没有发生明显的凋亡。因此，我们认为，利用3T MRI动态示踪SPIO标记的细胞，可较好地显示移植细胞在活体内的分布和迁徙，有望成为无创、动态、直观的组织工程种子细胞示踪方法。

综上所述，本研究通过用不同浓度的SPIO体外标记ADSCs，证实低浓度的SPIO不会影响细胞的活力和增殖等生物学行为，与研究[17]的结果一致；体外及体内MRI扫描示，50 μg/mL的SPIO标记细胞可有效地显示细胞在体内的生存和转归情况。尽管SPIO在MRI中的应用极大地促进了细胞示踪及细胞治疗技术的发展，为组织工程的临床应用提供了更多客观、准确的数据，但是，目前MRI示踪干细胞仍有很多的不足，如标志物是否影响干细胞的远期安全性、标志物是否影响干细胞在体内分化的转归、标志物在体内的代谢方向如何等。因此，在以后的研究中，需要通过提高MRI技术及改善标志物的理化性质等来进一步研究干细胞在体内的迁徙、分化和转归的进程。

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通讯作者陈财忠，E-mail:chen.caizhong@zs-hospital.sh.cn

△刘锴和李春波对本文有同等贡献，为共同第一作者。

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