转化生长因子-β1在丹红改善早期慢性肾脏病大鼠肾脏病理损伤中的作用

杨青梅　沈颖婧　 鲍晓荣　史继敏　张继红

(复旦大学附属金山医院a肾内科，b中心实验室，上海　201508)

·论著·

转化生长因子-β1在丹红改善早期慢性肾脏病大鼠肾脏病理损伤中的作用

杨青梅a沈颖婧a鲍晓荣a史继敏b张继红b

(复旦大学附属金山医院a肾内科，b中心实验室，上海201508)

摘要目的：探讨中药丹红对早期慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)大鼠肾脏病理损伤的疗效及TGF-β1在其中的作用。方法： 将30只雄性SD大鼠随机分为模型组、对照组和干预组，每组10只。3组大鼠分别给予单侧肾切除建立早期CKD模型、假手术(逐层分离组织至肾包膜，但不做肾切除)和建立早期CKD模型后丹红干预。观察各组大鼠肾脏病理改变、24 h尿蛋白量和肾功能，分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫组织化学法检测肾皮质中转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)浓度和肾组织总TGF-β1表达情况。结果：与对照组相比，模型组大鼠肾小球轻中度系膜细胞增生伴局部系膜基质增宽、球囊壁粘连及毛细血管壁改变，肾小管间质存在不同程度炎性细胞浸润与间质纤维化；与模型组比较，干预组大鼠肾脏病变明显减轻；模型组的肾脏病理总积分高于对照组(P<0.05)，而干预组低于模型组(P<0.05)。模型组与干预组24 h尿蛋白量高于对照组(P<0.01)，干预组24 h尿蛋白量低于模型组(P<0.01)。3组血肌酐、尿素水平无显著差异，但模型组和干预组血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂浓度较对照组明显增高(P<0.05)。模型组大鼠肾皮质TGF-β1浓度和肾组织总TGF-β1表达水平明显高于对照组(P<0.05)，干预组两者均低于模型组 (P<0.05)。肾组织TGF-β1表达与尿蛋白量、肾脏病理损伤总积分均有显著相关性(P<0.01)。结论：丹红能通过下调TGF-β1表达改善早期CKD大鼠肾脏病理病变。

关键词慢性肾脏病；转化生长因子-β1；丹红

中图分类号R692

文献标识码A

Role of Transforming Growth Factor β1 in Improving Renal Pathological Lesions of Rats with Early Chronic Kidney Disease withDanhongYANGQingmeiaSHENYingjingaBAOXiaorongaSHIJiminbZHANGJihongb

aNephrologyDepartment,bCentralLaboratory,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China

AbstractObjective：To explore the efficacy of traditional chinese medicineDanhongon renal pathological lesions of rats with early chronic kidney disease (CKD) and the role of transforming growth factor β1(TGF-β1) in it. Methods:Thirty male SD rats were divided into three groups: the early CKD group (model group), the sham-operated group (control group) andDanhongtreated group (treated group), with 10 in each group. Rats in the three groups were treated by uninephrectomy for building up early CKD model, sham-operation (separating tissues to renal capsule without kidney excision), andDanhongtreatment after building up model, respectively. Renal pathological lesions, 24 h urine protein excretion and renal function were observed. The concentration of TGF-β1 in renal cortex and overall expression of TGF-β1 in renal tissue was examined by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry, respectively. Results: Mild to moderate proliferation of glomeruli mesangial cells accompanied by broadened mesangium matrix, glomeruli capsule wall adhesion and change of capillary wall, interstitial fibrosis and inflammatory monocytes infiltration was found in the model group other than the control group. Renal lesions were alleviated dramatically in treated group, while compared to that in model group. The gross renal pathological score in model group was higher than that in control group (P<0.05), however, the score in treated group was lower than that in model group (P<0.05). The 24 h urinary protein excretion in model group and treated group was higher than that in control group (P<0.01), while the 24 h urinary protein excretion in treated group was lower than that in model group (P<0.01). There was no significant difference among the three groups regarding blood creatinine level and urea level. Serum CysC levels in model group and treated group increased significantly than that in control group (P<0.05). The concentration of TGF-β1 in renal cortex and overall expression of TGF-β1 in renal tissue were higher in model group than those in control group(P<0.05), while those in treated group were lower than those in model group (P<0.05). TGF-β1 expression level in renal tissues was significantly associated with both the urinary protein excretion and the total renal pathological scores (P<0.01). Conclusions:Danhongalleviated renal pathological lesions by down-regulating TGF-β1 expression.

Key WordsChronic kidney disease；Transforming growth factor β1；Danhong

慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)是一种缓慢进展性疾病。其发病率高，知晓率和治疗率低。早期诊断和治疗是决定CKD患者预后的关键因素。肾脏纤维化是各种CKD进展至终末期肾衰竭的共同表现，主要特征为细胞外基质(ECM)堆积、肌成纤维细胞增多以及肾小管炎性细胞浸润[1]。TGF-β1在促进肾脏炎性反应和纤维化过程中发挥关键作用[2]。轻度肾功能损害患者的TGF-β1水平已高于正常人群[3]。丹红能够抑制TGF-β1的表达、改善组织纤维化，在不同CKD动物模型中能同时减轻肾组织损伤和下调局部TGF-β1表达[4-5]，但目前对其在早期肾脏损害中的作用尚不明确。本研究采用单侧肾切除法建立CKD大鼠模型，探讨丹红对早期CKD的治疗价值及与TGF-β1的关系，以期为早期CKD的治疗提供更多的选择，并为丹红临床干预CKD提供理论依据。

1资料与方法

1.1动物及模型建立健康清洁级雄性SD大鼠30只，6周龄，体质量160 g左右。30只SD大鼠适应性喂养1周后随机分为3组：模型组、对照组和干预组，分别予以单侧肾切除法建立早期CKD动物模型[6]、假手术(切开皮肤分离皮下组织、肌肉，直至肾脏，但不作肾切除，再依次缝合各层组织)及建立早期CKD模型后给予丹红干预。术后1周起， 模型组和对照组大鼠给予0.9%氯化钠液[7 mL/(kg·d)]腹腔注射，干预组以等量丹红注射液(山东菏泽步长制药有限公司， 国药准字：Z20026866，批号： 12081007，10 mL/支)腹腔注射。3组大鼠均于术后12周处死。

1.2大鼠肾脏病变情况处死大鼠后切除左肾，部分肾组织以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，行苏木精-伊红染色(H-E)、过碘酸-无色品红染色(PAS)、六胺银染色(PASM)和Masson染色，由肾脏病理科医师在光镜下观察 。参照文献[7-8]分别对肾小球硬化、肾小球基底膜 (glomerular basement membrane, GBM)病变和肾间质纤维化程度进行分级，计算相应的病理积分。三者积分之和定义为肾组织病理总积分 。

1.324 h尿蛋白量和肾功能指标用代谢笼收集大鼠24 h尿液，应用美国强生公司Vitros 350全自动干式生化分析仪测定尿蛋白浓度并计算24 h尿蛋白量(mg/d)，即尿蛋白浓度(mg/mL)×24 h尿量(mL/d)。动物处死后自心脏采血，4000 r/min离心10 min获取血清，应用美国罗氏公司P800全自动生化分析仪检测血肌酐(Scr)、尿酸(UA)和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin C, CysC)浓度。

1.4肾皮质TGF-β1浓度检测处死大鼠后，取部分肾皮质组织，用4℃预冷的0.9%氯化钠液漂洗，滤纸拭干、称质量，加入 0.86%的0.9%氯化钠液，用内切式组织匀浆器研磨制成组织匀浆。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法(试剂盒由江苏南京建成生物工程研究所提供)检测肾皮质匀浆中TGF-β1的表达情况。

1.5肾组织TGF-β1免疫组化检测采用免疫组织化学方法检测肾组织TGF-β1蛋白的表达情况，并做半定量分析。将石蜡切片于60℃烘烤2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，pH 8.0 EDTA微波抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶；10%山羊血清室温封闭30 min；滴加兔抗人TGF-β1抗体 (美国Santa Cruz 公司)，于4 ℃孵育过夜；滴加通用型羊抗兔二抗(MaxVision TM HRP-Polymer anti-Rabbit IHC Kit，福建福州迈新生物技术开发有限公司)，室温孵育1 h后；用3,3-四盐酸二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木精复染；光镜下每张切片观察10 个高倍视野(×200)。采用JEDA 801D 形态学图像分析系统软件(江苏省捷达科技发展有限公司)分析视野内棕褐色阳性信号，计算TGF-β1 阳性表达率，即阳性信号占整个视野百分比的平均值。

2结果

2.1动物一般情况对照组、模型组和干预组大鼠各死亡1例，分别因不明原因麻醉过量、腹腔出血和麻醉后误吸水分窒息所致。存活大鼠毛发整齐、有光泽，食欲佳，活动正常。各组大鼠饮食量与体质量无明显差异。

2.2肾脏病理损伤情况与对照组相比，模型组肾小球轻中度系膜细胞增生伴局部系膜基质增宽、球囊壁粘连及毛细血管壁改变，肾小管间质有不同程度炎性细胞浸润与间质纤维化；与模型组比较，干预组肾脏病变明显减轻 。模型组的肾脏病理总积分高于对照组，干预组低于模型组；干预组肾小球硬化、肾小球基底膜病变和间质纤维化的单项积分均明显低于模型组(表1)。

注： 与对照组比较，#P<0.05 ； 与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3各组24 h尿蛋白量与肾功能指标比较模型组与干预组24 h尿蛋白量高于对照组，干预组的24 h尿蛋白量低于模型组。3组动物血Scr、UA无明显差异，但模型组和干预组血浆CysC浓度较对照组明显增高。见表2。

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4各组肾组织TGF-β1表达情况TGF-β1阳性表达于细胞质，经DAB 显色 、苏木素复染后呈棕黄色颗粒。3组大鼠肾小管上皮细胞、肾间质细胞和肾小球系膜细胞均见可见 TGF-β1棕黄色颗粒，其中以模型组表达最为显著。模型组阳性表达率明显高于对照组；干预组TGF-β1阳性表达率明显低于模型组 (表 3)。

注：与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01 ；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.5肾脏TGF-β1表达量与尿蛋白量及病理损伤的相关性经过单因素相关分析，肾皮质TGF-β1浓度和肾组织TGF-β1阳性表达率均与24 h尿蛋白量、肾组织病理总积分显著相关。见表4。

3讨论

本研究中，干预组在单侧肾切除后连续给予丹红注射液腹腔注射，至研究终点时，与未行干预的模型组比较，干预组肾组织病理损伤改善，24 h尿蛋白量明显减少。国内尚缺乏丹红注射液干预CKD的报道，但对其有效组分的研究较多，显示红花黄素可减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾间质的纤维化程度[9-10]，而丹参及其有效成分丹参酮能减轻大鼠梗阻性肾病肾小管病变和阿霉素肾病肾小球硬化等[11]。本研究首次对早期CKD动物模型进行丹红干预治疗，证实其能显著缓解甚至逆转肾脏病理损伤、降低尿蛋白量。但是，临床早期CKD患者是否能够从丹红治疗中获益，获益程度与剂量、疗程、遗传学背景关系如何等，尚有待明确。

1997年，Wu等[7]采用肾脏次全切除建立CKD大鼠模型，通过原位杂交证实，TGF-β1在病变肾脏的硬化肾小球、肾间质和浸润的单核细胞中呈高表达。Wang等[12]的研究中，切除5/6肾5周后的大鼠肾内TGF-β1呈高表达，肾小管间质明显损伤。本研究采用改良的单侧肾切除方法[6]建立了早期CKD大鼠模型，与对照组比较，模型大鼠表现出不同程度的肾小球系膜细胞、系膜基质、毛细血管壁及肾小管间质的损害，肾脏病理总积分明显增加；血清CysC浓度和24 h尿蛋白量升高，但SCr水平无明显变化。本研究中，免疫组化检测显示，TGF-β1在3组大鼠肾小管上皮细胞、肾间质细胞及肾小球系膜细胞均表达，其中以模型组表达最为显著，模型组TGF-β1阳性表达率明显高于对照组，提示在CKD早期，肾内TGF-β1已过度表达。TGF-β1可能通过以下机制促进肾脏损伤的病理进展：(1)激活Smad2、Smad3信号通路[13]，诱导 Smad3 依赖的细胞凋亡途径[14]和β1 整合素的表达，促进肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，分泌大量细胞外基质 (extracellular matrix，ECM)[13]；(2)抑制ECM 降解酶活性，增强肾小管细胞表面纤维蛋白溶解酶原激活物抑制剂-1的活性抑制 ECM 降解[15]；(3)促进肾小球系膜细胞血管内皮生长因子[16]和α-平滑肌肌动蛋白[9]的表达；(4)增强基质金属蛋白酶活性，导致蛋白水解，使肾小球基底膜增厚[17]。

本研究中，ELISA和免疫组化检测结果显示，干预组肾皮质TGF-β1表达较模型组减少，阳性表达率较模型组降低，提示丹红连续干预治疗能降低早期CKD大鼠肾组织中TGF-β1的表达。这与既往对丹参、红花的研究[10]结果一致，且是对二者联合作用的探讨。本研究单因素相关分析显示，肾皮质TGF-β1浓度及肾组织总TGF-β1阳性表达率均与 24 h尿蛋白量和肾组织病理总积分显著相关。TGF-β1表达水平越高，肾脏病理损伤越严重，尿蛋白量越多，提示TGF-β1过表达是早期CKD动物肾脏损伤的重要因素。而丹红能够抑制TGF-β1 的表达，进而保护肾组织，减少尿蛋白。

综上所述，单侧肾切除的早期CKD大鼠模型肾脏病理损伤较重，肾内TGF-β1高表达；腹腔注射丹红注射液后，肾脏病理损伤缓解，尿蛋白量减少，TGF-β1表达下调，提示丹红可能通过下调TGF-β1的表达改善早期CKD肾脏病理改变。

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通讯作者鲍晓荣，E-mail：yqingmay@163.com

基金项目：上海市卫生和计划生育委员会面上项目(编号：2011-295；2012-254)