代谢组学技术在筛选肝癌标志物中的应用

黎远冬 综述 匡志鹏 审校

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部

综述

代谢组学技术在筛选肝癌标志物中的应用

黎远冬 综述 匡志鹏 审校

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部

肝癌的早期诊断是提高患者生存率的一项重要措施。代谢组学通过对某些代谢产物进行“全景式”分析，并与正常人的代谢产物比较，筛查肝癌潜在的生物标志物，可能为一种较好的肝癌诊断方法。本文就近年来代谢组学技术在筛选肝癌标志物中的应用作一综述。

肝肿瘤；代谢组学；标志物；应用

肝癌的早期诊断是提高患者生存率的一项重要措施。AF P是目前肝癌诊断应用较广的标志物，在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的慢性肝炎、肝硬化中也能够观察到AF P浓度升高，血清AF P检测被认为不再是肝癌早期诊断的惟一筛选手段［1，2］，因此筛查合适的肝癌早期诊断标志物亟待解决。代谢组学（met a bo n om i cs）是20世纪90年代中期继基因组学、蛋白质组学、转录组学之后发展起来的一门新兴学科，是对一个生物系统的细胞在特定时间和条件下所有小分子代谢物质的定量分析［3，4］，与基因组学和蛋白质组学相比，代谢组学与生理学的联系更加紧密。因为疾病导致机体病理生理过程的变化，最终引起代谢产物发生相应的改变，通过对某些代谢产物进行分析，并与正常人的代谢产物比较，寻找疾病的生物标志物，将提供一种较好的疾病诊断方法。目前采用代谢组学方法筛选肝癌早期诊断的生物标志物逐渐成为研究热点，本文就此作一综述，以期为寻找理想的肝癌标志物提供新的途径。

1 代谢轮廓分析

临床上约80%的肝癌患者由肝硬化发展而来，肝硬化患者的再生结节与肿瘤非常相似，此外，慢性肝炎中约20%的患者AF P假阳性，在肝硬化患者中甚至有更高的AF P假阳性存在［5］，因此这两种人群的肝癌早期诊断比较困难。W an g等［6］采用超高效液相色谱-质谱联用仪（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-t an demm a ssspect r omet r y，UP L C-M S）进行血清代谢轮廓分析，从220种血清代谢物中筛选并鉴定出13种可能为肝癌患者主要代谢途径的重要障碍，其参与肝脏的有机酸、磷脂、胆汁酸和脂肪酸4个关键代谢通路；UP L C-M S联合血清AF P检查可较好鉴别肝癌患者、肝硬化患者及健康人，其敏感性和特异性均为100%，认为该法是在肝硬化高危人群中进行肝癌早诊的一种有效手段。在以往的研究中，标志物在肝硬化、肝癌的改变方向往往是相同的，比如标志物上调或下调。刀豆氨酸琥珀酸（C SA）是一种有机酸代谢物，是首次被鉴定在肝硬化组明显降低而在肝癌组中显著上调的代谢物。有趣的是，单独利用C SA诊断肝癌的灵敏性和特异性分别为79.3%、100%，高于AF P20或AF P200［6］。此外，C SA联合AF P20检查鉴别肝癌与肝硬化的灵敏性、特异性分别为96.4%、100%。认为C SA在鉴别肝癌与肝硬化中可能有重要的应用价值，建议在肝癌高危人群中利用C SA监测进行肝癌的早期诊断［6］。Zh o u等［7］采用血清代谢轮廓分析肝癌、慢性肝脏疾病和健康人群血清共同和特异性代谢改变。血清内源性大麻素（AEA）和十六基乙醇胺（P EA）的水平在肝癌组中相对于慢性肝脏疾病、健康人群显著升高。单独或联合应用AEA、P EA鉴别慢性肝脏疾病与肝癌显示出较好的灵敏性和特异性，可作为区分肝癌、慢性肝脏疾病的潜在标志物。进一步研究乙肝病毒、丙肝病毒感染的肝癌患者血清代谢特征，发现两组病例中有相似的代谢轮廓，研究结果有助于探索共同的发病机制。X i a o等［8］采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱仪（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-q ua d r u polet i me of fl ig h tm a ss spect r omete r，UP L C-Q T OF M S）技术分析埃及肝癌、肝硬化人群中血清代谢物，筛选出鉴别肝癌、肝硬化相关的代谢物，然后通过同位素方法采用超高效液相色谱-三重四极线性离子阱（u lt r a-h ig h pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-t ri ple q ua d r u pole l i n e a r i o n t r a p，UP L C-QqQL IT）技术对筛选出的代谢物及其他肝癌候选标志物进行定量分析，结果胆汁酸代谢物甘氨脱氧胆酸、油酰肉毒碱等表达水平在肝癌、肝硬化人群中有显著差异，认为筛选的代谢物可作为鉴别肝硬化与早期肝癌的候选标志物。

2 脂类代谢组学分析

脂类代谢异常与肿瘤的发生、发展有密切联系。脂类代谢组学能揭示与肿瘤相关的脂类变化，寻找其异常的代谢通路，在寻找用于肿瘤早期诊断的脂类标志物方面展现出广阔的前景。C h e n等［9］利用脂类代谢组学技术研究慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者的血清，结果鉴定出卵磷脂、鞘磷脂、三酰基甘油酯、胆固醇酯等96种脂类代谢物，其中75种脂类代谢物的表达异常，相对于健康组、肝炎组，在肝硬化组、肝癌组中大多数脂类代谢物均下调。认为血清脂类代谢物可以反映肝功能状态。Pa tte r so n等［10］采用超高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱法（u lt r a pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h yelect r osp r a y i o n i za t i o n-q ua d r u pole t i me-of-fl ig h tm a ss spect r omet r y，UP L C-ES I-T Q M S）联合气相色谱质谱联用仪（g a s c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y，G C-M S）技术分析肝癌、肝硬化、急性髓系白血病以及健康人群血清中脂类代谢物，发现2种结合胆汁酸、2种胆汁色素在肝癌中上调，11种lysop h osp h oc h ol i n es（L P C）分子下调，而二十四烷酸、神经酸在肝癌中几乎不表达，所有这些脂类分子改变对研究肝癌病理学提供了新的见解。

3 靶向代谢组学分析

采用代谢组学研究在健康和疾病状态下生物样本中所有代谢物的规律揭示与疾病发生、发展相关的代谢产物，必然获得海量的信息，这些信息包含大量干扰潜在标志物筛选的外源性代谢物信息，有可能使一些真正有价值的潜在标志物缺失。靶向代谢组学分析是采用标准品进行验证预先确认的代谢物的一种定量分析方法。Ban i a s a d i等［11］以L C-M S/M S为分析平台，对与重要代谢物通路有关的73种代谢物进行靶向代谢组学分析，并比较肝癌、丙型肝炎病毒感染的肝硬化病例，结果16种代谢物在两组病例中显著改变，采用最低P值方法进一步筛选出蛋氨酸、5-羟基-2-脱氧尿苷、N2，N2-二甲基鸟苷、尿酸4种候选生物标志物，联合多元统计分析推导出一种精确的诊断模式，该诊断模式能够很好识别肝硬化与肝癌人群，其灵敏性、特异性分别为97.0%、95.0%，对于了解肝癌高危人群在肝癌发生、发展过程中代谢物改变规律提供一种理想的手段。

4 利用尿液筛选肝癌标志物

尿液作为更易获得的生物样品，和血清一样包含大量因疾病而改变的代谢信息，利用代谢组学方法从尿液中筛选肝癌潜在生物标志物已取得快速发展。S ha ri ff等［12］研究丙型肝炎病毒感染的埃及人群中肝癌、肝硬化及健康组的尿液，鉴定出有鉴别价值的甘氨酸、氧化三甲胺、马尿酸盐、柠檬酸盐、肌酸酐、肌酸和肉毒碱7种代谢物。应用偏最小二乘判别分析（P L S-D A）建立的识别模型进行诊断，区分肝癌组与健康组、肝癌组和肝硬化组的敏感性与特异性分别为100%vs 94%和81%vs71%。S ha ri ff等［13］用同样的方法研究主要由乙型肝炎病毒感染的尼日尼亚人群中肝癌、肝硬化及健康人群的尿液也得到类似结果，首次在两种病因、不同人种中得到肝癌尿液相似代谢物的改变，认为代谢物改变与肿瘤有关，而与种族和病因学无关。C h e n等［14］联合气相色谱飞行时间质谱（g a s c h r om a to gr a p h y t i me-of-fl ig h tm a ss spect r omet r y，G C-T OF M S）和UP L C-Q T OF M S两个分析平台对血清、尿液两种生物样品不同类型的肝癌、肝血管瘤及健康人群进行代谢组学研究，发现并鉴定出与胆汁酸、游离脂肪酸、糖酵解、尿素循环、蛋氨酸等代谢通路有关的43种血清代谢物及31种尿液代谢物。通过两个分析平台、两种生物样品对代谢物进行交叉验证，显示甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸和鹅去氧胆酸与肝硬化及肝炎有关，应用建立的诊断模式能够100%鉴别AF P小于20 n g/ml的肝癌与健康人群。研究结果显示，建立的代谢组学诊断方法有可能成为肝癌诊断及分类的有效筛选工具。

5 问题与展望

目前应用最广泛的代谢组学分析平台是液质联用仪（l i q u i d c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y，L C-M S）［15］。由于代谢物丰度、物理、化学性质的差异及离子化期间基体效应的离子抑制或放大作用等多因素影响，在实际应用中基于L C-M S的技术平台进行代谢组学研究的仅仅是一种半定量信息，分析方法有较大局限性和不确定性。

人体中各类内源性小分子代谢物有上万种。尽管各种分析技术平台在代谢物及代谢途径方面的研究已取得快速发展，但由于生物样本的复杂性、多样性和不稳定性以及每个技术平台存在的局限性，因此没有任何一个技术平台能够满足所有代谢物测量需要，目前代谢组学研究的只是全部代谢物的少部分［5～14］，我们仅了解5%～10%。如何拓宽代谢组学检测的覆盖范围，排除外界因素干扰是目前代谢组学研究需要解决的问题。因此，代谢组学研究最大的挑战在于对代谢产物的识别及进一步解释所发现的代谢物与生物过程或生物状态之间的关联。

通过添加同位素标记的类似物内标调整离子基体效应和试样损耗，采用L C/ES I-M S平台再次对标本进行靶向代谢轮廓定量分析。靶向代谢轮廓分析可以使代谢物检测更准确且范围向低浓度延伸，因此在增加定量的准确性的同时也扩大了检测的覆盖范围。另外，反相色谱柱与亲水色谱柱联合作为代谢物的色谱分离柱能弥补单一反相色谱极性代谢物鉴定较少的缺点，拓宽了检测的覆盖范围。

总之，代谢组学目前尚处在初生阶段，我们对这些分子的作用仍然知之甚少。但是，相信随着其方法的不断完善和优化，代谢组学研究必将成为人类更高效、准确地诊断疾病的一种有力手段。

［1］ S tef an i u k P，C i an c i a r a J，W i e r c i n sk a-D r a p a lo A.P r ese n t an d f u t u r e poss i b i l i t i es fo r e a r ly d i a g n os i s of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.Wo r ld J G a st r oe n te r ol，2010，16（4）：418-424.

［2］B r u i x J，S h e r m an M，A me ri c an A ssoc i a t i o n fo r t h e S t u dy of L i ve r D i se a ses.Mana g eme n t of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.H ep a tolo g y，2005，42（5）：1208-1236.

［3］ Ni c h olso n J K，L i n do n J C.S ystems b i olo g y：M et a bo n om i cs［J］.N a t u r e， 2008，455（7216）：1054-1066.

［4］ H olmes E，W i lso n ID，Ni c h olso n J K.M et a bol i c p h e n otyp i n g i n h e a lt h an d d i se a se［J］.C ell，2008，134（5）：714-717.

［5］ C h e n L，H o D W，Lee N P，et a l.E nhan ced detect i o n of e a r ly h ep a tocell u l a r c a r c i n om a by se r u m SE L DI-T OF p r oteom i c s ig na t u r e comb i n ed w i t h a lp ha-fetop r ote i n m a r ke r［J］.A nn S u rg O n col，2010，17（9）：2518-2525.

［6］ W an g B，C h e n D，C h e n Y，et a l.M et a bo n om i c p r of i les d i sc ri m i na te h ep a tocell u l a r c a r c i n om a f r om l i ve r c irr h os i s by u lt r a pe r fo r m an ce l i q u i d c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y［J］.J P r oteome R es，2012，11（2）：1217-1227.

［7］ Zh o u L，D i n g L，Y i n P，et a l.S e r u m met a bol i c p r of i l i n g st u dy of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a I n fected w i t h h ep a t i t i s B o r h ep a t i t i s C v ir u s by u s i n g l i q u i d c h r om a to gr a p h y-m a ss spect r omet r y［J］.J P r oteome R es，2012，11（11）：5433-5442.

［8］ X i a o J F，V a r q h ese R S，Zh o u B，et a l.L C-M S b a sed se r u m met abolom i cs fo r I de n t i f i c a t i o n of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a b i om a r ke r s i n Eg ypt i an co h o r t［J］.J P r oteome R es，2012，11（12）：5914-5923.

［9］ C h e n S，Y i n P，Zha o X，et a l.S e r u m l i p i d p r of i l i n g of p a t i e n ts w i t h c h r o n i c h ep a t i t i s B，c irr h os i s，an d h ep a tocell u l a r c a r c i n om a by u lt r a f a st L C/IT-T OF M S［J］.E lect r op h o r es i s，2013，34（19）：2848-2856.

［10］ Pa tte r so n A D，Mau r h ofe r O，B eyo g l u D，et a l.A be rr an t l i p i d met abol i sm i n h ep a tocell u l a r c a r c i n om a r eve a led by pl a sm a met a bolom i cs an d l i p i d p r of i l i n g［J］.C an ce r R es，2011，71（21）：6590-6600.

［11］Ban i a s a d i H，G owd a GA，G u H，et a l.T a rg eted met a bol i c p r of i l i n g of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a an d h ep a t i t i s C u s i n g L C-M S/M S［J］.E lect r op h o r es i s，2013，34（19）：2910-2917.

［12］S ha ri ff M I，G om aa A I，C ox I J，et a l.U ri na r y met a bol i c b i om a r ke r s of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a i n an Eg ypt i an pop u l a t i o n：a v a l i d a t i o n st u dy［J］.J P r oteome R es，2011，10（4）：1828-1836.

［13］ S ha ri ff M I，L a dep NG，C ox I J，et a l.C ha r a cte ri za t i o n of u ri na r y b i om a r ke r s of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a u s i n g m a g n et i c r eso nan ce spect r oscopy i n a Nig e ri an pop u l a t i o n［J］.J P r oteome R es，2010，9（2）：1096-1103.

［14］C h e n T，X i e G，W an g X，et a l.S e r u m an d u ri n emet a bol i te p r of i l i n g r eve a ls pote n t i a l b i om a r ke r s of hu m an h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］. M ol C ell P r oteom i cs，2011，10（7）：1-13.

［15］B ecke r S，K o r t z L，H elmsc h r odt C，et a l.L C-M S-b a sed met a bolom i cs i n t h e cl i n i c a l l a bo r a to r y［J］.J C h r om a to gr B A na lyt T ec hn ol B i omed L i fe S c i，2012，883-884：68-75.

［2014-10-22收稿］［2014-12-18修回］［编辑 罗惠予］

R735.7

A

1674-5671（2015）04-03

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.16

广西医疗卫生重点科研基金资助项目（重2012090）