全自动免疫组化染色平台在临床病理检查中的应用

覃思繁 韦常宏 罗元 林思彤 黄俊淇 陶展飞

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院病理科

技术与方法

全自动免疫组化染色平台在临床病理检查中的应用

覃思繁 韦常宏 罗元 林思彤 黄俊淇 陶展飞

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院病理科

目的 探讨全自动免疫组化染色仪在临床病理检查中的应用价值。方法 用统一的二抗，同一种一抗对临床常用于检测乳腺癌的ER、PR、HER-2、Ki-67、p53等5种免疫组化抗体，分别采用全自动免疫组化仪（实验组）和手工操作法（对照组）进行免疫组化染色，对比两组检测的结果。结果 实验组和对照组ER、PR、HER-2、Ki-67、p53等5种免疫组化抗体在边缘效应、特异性、着色情况、背景等均有差异。全自动免疫组化染色仪染色结果均匀，阳性定位准确，背景较清晰，无边缘效应，检测结果理想，优于手工操作法。结论 全自动免疫组化染色仪工作比较稳定，染色效果优良，标准化程度高，能减少手工操作的误差，易于质量控制，可为临床诊断和治疗提供更加准确和科学的实验依据。

全自动免疫组化染色仪；免疫组化；手工操作法；标准化；质量控制；应用

在我国，乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位［1］，随着乳腺癌综合诊治水平的提高，对临床病理诊断的质量要求亦越来越高，乳腺癌常用的检测指标ER、PR、HER-2、Ki-67、p53对指导乳腺癌的治疗至关重要［2］。优良的免疫组化检测结果是正确病理诊断的前提和基础，因而受到普遍重视。由于免疫组化是一种较强的技术性操作，每一步实验操作都有可能影响最后的检测结果［3］。同时，外界因素也可以影响实验结果，如天气状况、时间、环境温度、个人操作方法等，所以免疫组化的标准化和质量控制一直是病理技术关注的问题。全自动免疫组化染色仪的问世，使免疫组化实现了相对标准化［4］。本实验采用全自动免疫组化染色仪染色（简称全自动法）与手工操作染色法（简称手工操作法）对乳腺癌ER、PR、HER-2、Ki-67、p53 5种抗体进行免疫组化染色，比较两种染色方法的检测结果。

1 材料和方法

1.1 仪器与设备

美国罗氏公司BenchMark XT全自动免疫组化检测主机（包括试剂模块、染色模版及废液收集模块），与之配套使用的联想计算机及专业操作软件（VENTANA）、激光条码标签打印机、不间断电源仪等。

1.2 材料

用APES与丙酮按1∶50混合配制处理过的防脱载玻片，常规制备待检乳腺癌组织切片，随机选取我科2012年2～4月的乳腺浸润性导管癌组织标本3例。按一定比例配制牛奶液、洗洁精等。

1.3 试剂

选用福州迈新公司的即用型一抗ER、PR、HER-2、Ki-67、p53，系统配套使用的试剂盒（主要包括二抗、DAB显色液、苏木素复染液等），不含有机溶剂的脱蜡液、封盖清洗缓冲液、氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液、CC1细胞预处理液、CC2细胞预处理液、选择液等。

1.4 实验方法

选择3例乳腺浸润性导管癌组织标本蜡块，实验分为全自动免疫组化仪染色（实验组）和手工操作染色（对照组）。乳腺浸润性导管癌3例，每例选取一个蜡块，每一蜡块同时用两种方法检测ER、PR、HER-2、Ki-67、p53 5种抗体，即一个蜡块常规连续切取10张白片（4μm），并将切片浸于预先经过2%APES丙酮处理过的防脱玻片上，65℃烤片1 h左右，其中5张白片用于实验组（一张白片做一个抗体），另外5张白片用于对照组。两组实验均设阳性对照和阴性对照。⑴对照组采用Elivison两步法进行染色。⑵实验组采用配套的操作程序（VENTANA）完成染色，具体步骤：①首先将检测用的5种免疫组化试剂的标签打印好并贴在试剂瓶上，然后进行编程，主要包括烤片、脱蜡、一抗和二抗的时间、温度、复染的时间等；②将即用型的一抗ER、PR、HER-2、Ki-67、p53直接填充于与主机配套的专门试剂瓶，并编辑扫描试剂瓶上的激光条码；③将与系统配套的检测试剂套装安装于可拆分的试剂架上，主要包括二抗、DAB显色液、苏木素复染液等；④按说明书要求对与主机配套散装液体按比例进行配制，主要包括不含有机溶剂的脱蜡液、封盖清洗缓冲液、氯化钠柠檬酸钠清洗缓冲液、CC1细胞预处理液、CC2细胞预处理液、选择液等，并安装在主机相应位置的试剂瓶中；⑤编辑打印条码切片标签（5种抗体为ER、PR、HER-2、Ki-67、p53），将标签贴在切片的相应位置上，并将待检的切片按顺序放入染色仪的操作槽中；⑥点击软件中的“RUN”键，设定本次检测的组织片数，点击“确认”开始运行程序，机器在运行期间不可按“STOP”键。此时全部染色工作均由机器完成；⑦自动完成染色后，机器自动报警，取出切片，用洗洁精清洗切片上的油膜和试剂，梯度酒精脱水，中性树胶封片。

2 结果

全自动法染色结果较稳定，染色均匀，阳性定位准确，非特异性着色较少，背景较清晰。手工操作法染色阳性信号相对较弱，边缘有泛黄现象，但背景较清晰。见表1和图1～图5。

3 讨论

本实验采用全自动免疫组化染色仪和手工操作对乳腺癌5种抗体进行染色，现对染色的结果分析如下。

手工操作法染色：⑴工作流程难以控制和标准化，如手工脱蜡不干净，石蜡容易留在组织切片上，引起染色不均，阳性信号不强，甚至引起边缘效应。以上结果使ER、PR、HER-2、Ki-67、p53染色不均及有浅背景，可能与脱蜡过程中手工操作有一定的关系［5］。⑵在染色过程中，如果滴加抗体时间过长，加上手工操作没有恒定的湿度环境，容易造成组织干片出现非特异性背景着色及边缘效应［6］。本实验手工操作使ER、Ki-67、p53亦出现特异性染色及边缘效应。⑶手工操作过程中人为干扰因素很多，由于实验技术人员的手法不同，滴加抗体的量也不同，易与切片上残留的清洗液混合造成抗体浓度稀释，使抗体浓度下降，染色的阳性信号强度出现差异，造成实验的误差［7］，本实验中手工所做的ER、PR、HER-2、Ki-67、p53强度稍弱可能与此有关。⑷实验研究表明［8］，抗原修复是影响免疫组化结果的重要因素，手工操作由于人为原因易造成抗原修复不足，直接影响免疫组化结果的信号强度。BenchMark XT全自动免疫组化机可使修复液沸点高于100℃，同时满足较高的修复条件，能使抗原暴露充分。本实验HER-2、p53由于抗原修复不足，所以信号变弱，阳性率偏低。

表1 全自动法与手工操作法对乳腺癌组织染色结果的比较［n=3］

图1 乳腺癌ER染色法（4×10）

图2 乳腺癌PR染色法（4×10）

图3 乳腺癌HER-2染色法（4X10）

图4 乳腺癌K i-67染色法（4×10）

图5 乳腺癌p53染色法（4×10）

全自动法染色：⑴工作流程可全程标准化，从脱蜡、抗原修复、滴加一抗、二抗直到苏木素复染全程自动化［9］。本实验显示5种抗体染色均匀，基本上无背景。⑵在整个机器运行过程中，机器内部一直保持恒温、恒湿环境，不会造成组织干片，背景非特异染色很少，基本上无边缘效应［10］。⑶全程自动化有效避免了手工操作所致的人为误差，确保检测结果的稳定性。本实验显示ER、RP、HER-2、Ki-67、p53的强度均比手工操作强。⑷全自动免疫组化染色仪采用先进的加温技术，能使抗原修复更加充分［11］，所以实验中ER、RP、HER-2、Ki-67、p53的阳性表达普遍比手工操作的染色强。

近年来，病理学科大力强调免疫组化的标准化和质量控制，2000年国际标准化组织已提出了ER和PR的免疫组化染色的质量控制体系（QA）［12］，按照国际免疫组化标准化的要求，在病理科成功开展免疫组化技术的关键是标准化，全自动免疫组化染色仪则为实现标准化和质量控制提供了保证［13］。

每一个商业化的自动免疫组化平台都具有战略设计的差异，了解这些差异有助于更加客观地评价自动与手工之间的差异与优缺点［14］。本实验结果的差异可能与选取的病例数较少和选取的抗体有关。有报道国内其他实验室采用手工操作法进行免疫组化片染色效果较佳，有些甚至超过全自动免疫组化仪［15］。因此我们将在以后的工作中总结更多的病例和选用更多的抗体种类，以更加全面客观地评价两者的优缺点。

综上，本实验结果表明，与手工操作染色相比，全自动免疫组化仪染色均匀，背景清晰，边缘效应少，染色效果更佳；全自动免疫组化染色平台具有操作规范、标准化程度高的特点，可避免人工操作引起的误差，为病理科免疫组化质量控制提供坚实的保障，为临床诊断提供更加准确的依据。

［1］ 唐玮，刘剑仑，杨华伟，等.南宁市20 472名妇女乳腺癌筛查结果分析［J］.中国癌症防治杂志，2014，6（2）：180-182.

［2］ 季永领，杜向慧.乳腺癌骨转移的综合治疗［J］.中国癌症防治杂志，2014，6（2）：193-197.

［3］ 颜亚晖，郑晖.免疫组化化学切片质量的探讨［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2003，12（3）：333-334.

［4］ 杨会钗，刘世正.使用新型全自动免疫组化染色仪与手工操作比较的体会［J］.中华实用中西医杂志，2005，18（17）：922，292.

［5］ 王小亚，杨清海，黄奇平.免疫组织化学标准化（二）［J］.诊断病理学杂志，2008，15（2）：160-161.

R730.2

A

1674-5671（2015）04-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.14

广西壮族自治区卫生厅科研自筹课题（Z2011222）

韦常宏。E-mail：258894453@qq.com