荧光原位杂交技术在预测膀胱癌复发中的临床应用

蒙清贵　覃智标　白先忠　文亦磊　雷华

·临床研究·

荧光原位杂交技术在预测膀胱癌复发中的临床应用

蒙清贵覃智标白先忠文亦磊雷华

目的 采用荧光原位杂交（FISH）技术检测膀胱癌术后患者尿脱落细胞中染色体畸变情况，探讨FISH技术在预测膀胱癌复发中的实际应用价值。方法 采用FISH技术检测80例经尿道膀胱癌电切术后患者尿液脱落细胞染色体，观察FISH检测结果与肿瘤复发的相关性。结果 FISH检测后随访6~20个月，平均13个月，期间共35例出现肿瘤复发，其中FISH阳性30例（85.7%），阴性5例（14.3%）；余45例未见肿瘤复发，其中FISH阳性19例（42.2%），阴性26例（57.8%）。总体而言，FISH阳性患者出现肿瘤复发的比例高达61.2%（30/49），而FISH阴性患者出现肿瘤复发的比例则仅为16.1%（5/31）。FISH阳性患者较阴性患者更易出现肿瘤复发，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 FISH是一种无创、简便、快捷有效的预测膀胱癌术后复发的实验室检查方法，具有重要的临床应用价值，可为膀胱癌术后复发提供参考依据。

膀胱尿路上皮癌 荧光原位杂交技术 复发 预测

膀胱癌是我国泌尿外科临床上最常见的恶性肿瘤之一，其中，以尿路上皮癌最多见，约占膀胱癌的90%以上［1］。膀胱癌极易复发，目前，国内外已将荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术用于膀胱尿路上皮癌的诊断及对术后复发的监测［2，3］。本研究利用FISH技术检测膀胱移行细胞癌患者术后尿脱落细胞中3、7、17号染色体及9号染色体P16位点畸变情况，研究其与膀胱癌术后复发的相关性，进一步探索将其作为临床预测膀胱癌复发的方法。

1　临床资料

1.1一般资料 入组标准：影像学检查诊断为膀胱占位并于本院及广西中医药大学第一附属医院行经尿道膀胱肿瘤电切术，术后病理证实为膀胱尿路上皮癌者（肿瘤临床分期［4］≤T1期，即浅表性膀胱癌，膀胱鳞癌、腺癌等非尿路上皮癌需除外）；术后第3个月行膀胱镜检查未见明确肿瘤复发者。2010年1月至2013年12月，符合入组标准的患者共80例，其中男52例，女28例；年龄32～80岁，平均52岁。80例患者膀胱肿瘤电切术后标本病理分期［4］为原位癌（Tis）期15例，Ta期 29例，T1期36例； 高级别尿路上皮癌33例，低级别尿路上皮癌47例。

1.2实验器材 荧光原位杂交操作平台：微型计算机（美国戴尔），BX 51系统显微镜（日本奥林巴斯），BX-UCB通道转换系统（日本奥林巴斯），ProgResCapture pro 2.5摄像系统（日本奥林巴斯），VIDOTEST-FISH 2.0图像分析处理系统（香港友诚生物科技有限公司），SHHW21420三用恒温水浴箱（上海跃进）和HPX-9052MBE恒温培养箱（上海博迅），X-cite SERIES120荧光灯（北京中晟天成科技有限公司），TXZ5-WS台式离心机（长沙湘智），SevenMilti型pH/电导率/离子综合测试仪和T200型电子天平（常熟双杰），实验中应用的FISH试剂为GLPP16/CSP17（红色/绿色）和CSP7/CSP3（红色/绿色）两组（北京金菩嘉医疗科技有限公司）。

1.3FISH检测方法 收集80例患者的新鲜晨尿200 ml，按以下步骤检测。（1）玻片配制：200ml新鲜尿液标本离心10min后去上清液，加胶原酶B 2ml，37℃孵育20min，离心10min后去上清液，加5ml KCl低渗溶液，37℃孵育20min，加2ml甲醇固定液离心，去上清液，室温静置5min，再次离心、去上清液、加固定液重复固定1次，离心去上清液后滴片，室温下过夜老化玻片。（2）玻片处理：用RNase（美国Sigma公司，0.1g/L）和Pepsin（美国Sigma公司，0.1g/L）先后处理，多聚甲醛固定15min，磷酸盐缓冲液洗涤后，玻片加700ml/L甲酰胺/2×标准柠檬酸盐溶液（SSC）（pH7.0）溶液，72℃变性3min，2×SSC -4℃3min洗涤2次，梯度乙醇脱水，室温晾干。（3）杂交：按1μl去离子水、2μl探针、7μl缓冲液的比例制备探针混合液，将10μl探针混合液滴于玻片杂交区域，覆盖玻片，封片后后置湿盒37℃温箱中避光杂交48h。（4）洗片：去除盖玻片，将玻片放入500ml/L甲酰胺/2×SSC中42℃洗涤15min，2×SSC室温摇洗3min×2次，梯度乙醇脱水，室温暗处晾干，加2ml二氨基苯基吲哚（DAPI，Vysis公司）复染，封片送荧光显微镜下观察，电荷耦合元件（CCD）摄取图像进行图形分析统计。

1.4结果判定 结果判断严格依照金菩嘉公司提供的标准执行，GLPP16和CSP7探针为红色，CSP17和CSP3探针为绿色，共两种信号。4个探针中有≥2种的探针出现异常信号即可判定为阳性。嘱患者在行FISH检测后每3个月返院行膀胱镜检查及活检术，以标本病理结果证实为膀胱移行上皮细胞癌作为肿瘤复发的判断标准。

1.5统计学分析 采用 SPSS17.0统计软件。计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

80例膀胱癌患者行经尿道膀胱癌电切术后随访6～36个月，平均23个月，随访期间共35例患者出现肿瘤复发（43.7%，35/80），其中FISH阳性30例（85.7%，30/35），阴性5例（14.3%，5/35）；余45例患者在随访期间未见肿瘤复发（56.3%，45/80），其中FISH阳性19例（42.2%，19/45），阴性26例（57.8%，26/45）。整体而言，FISH阳性患者出现肿瘤复发的比例高达61.2%（30/49），而FISH阴性的患者肿瘤复发率则仅为16.1%（5/31）。可见，FISH检测呈阳性的患者膀胱癌复发率较阴性者高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

膀胱癌的发病率呈逐年增高的趋势。浅表尿路上皮癌主要采用经尿道膀胱肿瘤电切术（TUR-BT）治疗，经电切术等局部治疗后膀胱癌仍可再次甚至多次复发，其整体复发率＞70%。因此，在膀胱癌治疗后仍需定期复查、监测。研究［5］发现，膀胱癌患者的尿路上皮细胞常发生染色体结构的畸变和（或）数目异常等改变，结构畸变通常发生在1、3、5、9、11、17、21号染色体，而数目异常则多发生于1、3、7、8、9、10、11、Y、 15、17号染色体。目前用于膀胱癌诊断研究的染色体主要集中在3、7、9、11、17号染色体。已有研究［6，7］表明，3号染色体多倍体与肿瘤进展及恶性程度相关，7号染色体多倍体与肿瘤发生和进展相关，而17号染色体异常则与膀胱癌发生相关。FISH是利用碱基互补配对原理在核中或染色体中显示DNA序列位置的方法，通过对待测DNA进行定性、定量，从而可以发现相关染色体结构畸变或数目异常等情况。

国内外已将FISH技术应用于膀胱尿路上皮癌的诊断及对术后复发的监测，Halling［8］及Michael［9］均分别在对11例、36例膀胱镜检查阴性而FISH检查呈阳性患者的随访中发现，FISH阳性患者最终确诊为膀胱癌的比例较高，Halling报道为64%，Michael报道为41%。本组研究可见，80例随访患者中，FISH阳性患者出现肿瘤复发的比例较高，达61.2%（30/49），而FISH阴性的患者肿瘤复发率则较低，仅为16.1%（5/31）。两者差异有统计学意义（P＜0.05）。该研究结果将为预测膀胱癌术后复发提供一种简便、快捷有效的实验室检查方法，可为患者的预后提供参考。

1 那彦群,叶章群,孙光.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南2014版.北京：人民卫生出版社,2014.28.

2 Halling KC,King W,Sokolova IA,et al. A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma. J Urol,2000,164（5）： 1768～1775.

3 Veeramachaneni R,Nordberg ML,Shi R,et al. Evaluation of fluorescence in situ hybridization as an ancillary tool to urine cytology in diagnosing urothelial carcinoma. Diagn Cytopathol,2003,28（6）： 301～307.

4 Hong YM,Loughlin KR. Economic impact of tumor markers in bladder cancer surveillance. Urology,2008,71（1）： 131～135.

5 余凯远,翁志梁,李澄棣.尿脱落细胞荧光原位杂交技术诊断膀胱癌的价值.国外医学泌尿系统分册,2005,25（4）：449～452.

6 Kruger S,Mess F,Bohle A,et al. Numerical aberrations of chromosome 17 and the 9p21 locus are independent predictors of tumor recurrence in non-invasive transitional cell carcinoma of the urinary bladder. Int J Oncol,2003,23（1）： 41～48.

7 Inoue T,Sato K,Tsuchiya N,et al. Numeric aberrations of HER-2 and chromosome 17 detected by fluorescence in situ hybridization in urine-exfoliated cells from patients with urothelial carcinoma. Urology,2004,64（3）：617～621.

8 Halling KC,King W,Sokolova IA,et al. A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma. J Urol,2000,164（5）： 1768～1775.

9 Michael F,Sarosdy MF,Schellhammer P,et al.Clinical evaluation of a multi-target fluorescent in situ hybridization assay for detection of bladder cancer. J Urol,2002,168（5）：1950～1954.

Objective To explore the application of fl uorescence in situ hybridization（FISH）technique in the detection of bladder cancer patients with postoperative urine exfoliated cells chromosome aberration，discuss FISH technology in practical application value in predicting recurrence of bladder cancer. Method With FISH technology, 80 cases of transurethral bladder cancer postoperative patients were detected with urine exfoliated cells chromosome FISH test. The results were studied for their correlation with tumor recurrence. Results The patients were followed up for 6~20 months after FISH detection，with an average follow-up of 13 months，a total of 35 cases with tumor recurrence were examined during the follow-up period，including FISH positie 30 cases（85.7%），and negative in 5 cases（14.3%）. Patients with no tumor recurrence were found in 45 cases，in which the FISH positive 19 cases（42.2%），negative 26 cases（57.8%）. In general，61.2%（30/49）FISH positive patients were found of tumor recurrence, while the proportion of FISH negative patients were found of tumor recurrence in only 16.1%（5/31）. FISH positive patients are more likely to have tumor recurrence，with the statistically signifi cant difference（P<0.05）. Conclusion FISH is a noninvasive，convenient，quick and effective prediction of postoperative recurrence of bladder cancer laboratory examination method，has important clinical value，can provide the reference for the recurrence of bladder cancer.

Bladder urothelial carcinoma Fluorescence in situ hybridization technology Recurrence To predict

广西医疗卫生重点科研项目（2010093）

530021 广西医科大学附属肿瘤医院泌尿外科