Notch信号通路在组织血管化中的作用

刘虎仙雷永红综述，韩岩审校

（1.北京解放军总医院整形修复科北京100853；2.北京解放军第二炮兵总医院整形外科北京100088；3.北京解放军总医院第一附属医院全军创伤修复重点实验室北京100853）

·综述·

Notch信号通路在组织血管化中的作用

刘虎仙1，2雷永红3综述，韩岩1审校

（1.北京解放军总医院整形修复科北京100853；2.北京解放军第二炮兵总医院整形外科北京100088；3.北京解放军总医院第一附属医院全军创伤修复重点实验室北京100853）

组织移植中的血管新生是再生血管化基础，国内外在促进移植组织再生血管化这一临床难题上已经进行了大量的研究，有关基础研究集中在外源因子促进ECs增殖［1-2］。但是，至今尚未阐明组织移植血管化过程中ECs的信号调控机制。当前，血管形成过程中的Notch信号通路在细胞分化、增殖、迁移等方面功能的研究已非常深入［3-4］。因此，本文对此进行综述，希望透过信号网络的视角能够为移植组织再生血管化研究提供一些思路。

1　血管新生（neovasculorization）的基本过程

根据血管形成中内皮细胞来源的不同，血管新生包含两个基本过程和形式：即血管发生（vasculogenesis）和血管生成（angiogcnesis）。前者主要见于胚胎发育时，血管内皮细胞来源于其前体即内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs），这种血管新生方式由中胚层的成血管细胞发育成血管系统。这种形式的血管发生可分为五个步骤［5·］：首先，内皮祖细胞分化为内皮细胞；之后，内皮细胞形成原始聚合体建立细胞间连接；再次，新生内皮管腔形成；进而，新生内皮管腔形成原始血管网；最后，周细胞、血管平滑肌细胞形成。以往认为，血管发生不在胚胎时期的器官形成之外过程的发生。但亦有报道在成人中发现了来源于骨髓中的EPCs被动员到外周血中，随后参与血管化过程［6-7］。在皮肤移植的血管化研究中也发现了上述类似的现象［8］。这些发现表明出生后的血管化不仅依靠血管生成（angiogcnesis），也可能依靠EPCs血管发生（vasculogenesis）。血管生成（angiogcnesis）是指已经存在的微血管内皮细胞通过出芽亦或非出芽或套叠等方式生长血管。出芽是常见的血管生成方式，即原始血管丛形成后，已形成的血管内皮细胞外基质降解，内皮细胞趋化、迁移至外基质降解处，并增殖形成有功能的管腔［4，9］。与血管发生不同，血管生成形态发生分为：①原代血管的扩张，减少内皮细胞接触；②原代血管基底膜被降解；③形成新生血管起始端；④毛细血管腔样结构形成；⑤基底膜合成；⑥周细胞和血管平滑肌细胞的形成。已生成的交换毛细血管柱或者细胞外基质柱分裂形成腔隙的过程则认为是非出芽或套叠方式的血管生成。

尽管血管形成调控机制庞杂，但业已明确血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受体（VEGF receptors，VEGFR）在其中发挥着关键作用，控制着血管内皮细胞的增殖、生存和迁移，并最终导致血管形成。在VEGF等多种信号通路的共同调控下，血管内皮细胞发生分化产生极性改变［10］。根据其特性和位置，在血管形成中的部分呈丝状伪足改变的内皮细胞称为尖端细胞（tip cell），另一类重要的血管内皮细胞称为柄细胞。血管形成中，尖端细胞对于血管芽生及促成分支起作用，柄细胞随之跟进完成新生血管的增殖。不同部位的内皮细胞存在不同浓度梯度的VEGF-A。尖端细胞感受到特定方向VEGF-A的刺激后，在特定方位通过丝状伪足获得延伸。紧随细胞不断增殖以满足血管芽延伸和血管腔形成，最终形成成熟血管。最后，位置相邻的尖端细胞之间相互融合，进一步形成血管网。这样，从最初的EPCs分化为成熟的内皮细胞，到新的毛细血管从原先存在的血管生出，这些细胞在无血管的区域增殖并且创造了第一个初始的血管网络［11］。这个过程由多种元素共同参与和相互作用而产生，包括各种类型的细胞、黏附蛋白、生长因子、连接分子、内源性抑制剂等［12-13］。此外，具有生理功能血管的形成，不仅需时间顺序上的精确调节，也要在其成熟后抑制内皮细胞的过度生长，从而抑制过多的营养和氧气供应到组织［14］。越来越多的研究表明，Notch信号通路在整个血管新生的过程中起关键的调控作用［15］。

2　Notch信号通路的基本组成

1914年，有研究者发现果蝇翅膀边缘缺口（notch）是由其体内某一基因的部分功能缺陷所导致，该基因即被命名为Notch基因［3］。后续的研究中人们把与这一现象相关的信号通路称之为Notch信号通路。均为单次跨膜蛋白的Notch信号受体和配体直接介导了细胞间的相互作用。该通路主要由四部分组成：受体、配体、下游转录调控分子以及靶基因［16］。哺乳动物存在四种Notch受体，即Notch1、Notch2、Notch3、Notch4，均为多肽段构成的异二聚体。四种受体均有胞内区、胞外区及跨膜区。其中胞外区域包含有29～36个表皮生长因子EGFR样的重复序列，而且第11～12个EGFR序列介导了受体与配体间的相互作用。Notch的胞外区域最主要的功能就是与配体结合并且负责将Notch信号向细胞内传递而导致Notch信号通路激活，而Notch信号胞内区域的主要作用就是将Notch信号传送到细胞核内［17］。哺乳动物中共发现5个Notch配体［3］：即Dleta样配体Dll4、Dll3、Dll1，Serrate样配体Jagged-1、Jagged-2。Notch的配体同样也具有EGFR样的重复序列。Dll4是定位于人染色体15q14、基因编码长度为685个氨基酸的单链跨膜蛋白。DLL4编码蛋白在鼠和人中具有87%的同源序列［18］。提示DLL4在生物进化过程中保持了高度的保守性。在5个Notch配体中，有作者发现DLL4是唯一特异性表达于内皮细胞，在病理性新生血管生长过程中及血管和淋巴管的新生、发育和成熟过程中起关键作用。

3　Notch信号通路血管生成中的作用机制

研究表明，相邻细胞的Notch受体与其配体可相互结合从而激活Notch信号通路，扩大并造成细胞之间的分子水平差异，并最终导致细胞命运、器官形成和形态发生关键变化。

3.1 Notch信号通路作用的基本模式

Notch信号通路参与诱导和挑选尖端细胞，是血管密度的一个关键调控因子，在血管发生中扮演着重要作用，并与VEGF信号通路存在正负反馈调节，使血管协调高效的形成［19］。Dll4与Notch受体结合后，下调VEGFR的表达，抑制VEGF-A的效应，显示出抑制血管分支效应［20］。阻断DLL4/Notch信号通路后，表现为尖端细胞形态特征突出，血管分支增加，血管密度大幅增高。从而表明DLL4/Notch信号通路对VEGF诱导激活尖端细胞的作用形成重要的负反馈调节，即Notch信号的异位激活或缺失分别导致血管密度的减少或增加。柄细胞中的Notch信号负反馈抑制细胞核内VEGF受体的表达，通过降低柄细胞与VEGF-A之间的响应来抑制其向尖端细胞表型分化趋势，从而维持自身表型［21］。同时，降低柄细胞中Dll4的表达水平，导致尖端细胞只能接受较低活性的Notch信号，自身表型也得以维持。在柄细胞中高表达的Notch配体Jagged-1能拮抗其的Dll4，阻碍尖端细胞接受Notch信号，参与调控尖端细胞的挑选过程［22］。上述说明，内皮细胞中的Notch信号活性和VEGF-VEGFR/Dll4-Notch这一信号回路处于动态平衡，从而保证了正常的血管萌芽和血管网络构建。

3.2 Notch信号通路的细胞组织特异性

需要指出的是，Notch信号通路在血管生成及组织再生血管化过程是否具有细胞特异性？原位杂交表明，Dl14集中表达在胚胎和成年组织的血管内皮细胞，具有非常严格的组织特异性［23］。业已明确，Dl14很少在其他类型细胞表达，而主要表达在新生血管末端尖端细胞中［17］。在血管形成的数个阶段，Dll4-Notch信号传导通路均参与其中Dll4的组织定位或许间接提示它在新生血管的生长、发育、成熟过程中具有关键的作用。并与其他细胞因子或信号通路相互交织，共同完成血管形成中的复杂调控。

3.3 Notch/Dll4信号通路的作用环节

Notch/Dll4信号通路在血管内皮细胞激活启动血管形成方面提供了关键的调节信息，且Dll4组织定位于新生血管末端尖端细胞中。则进一步需要证实的是，Notch/Dll4信号通路在血管生成的信号网络中在哪个关键环节发挥作用？有文献报道，减少VEGF的表达，Dll4的表达同时下降［24］。VEGF能同时诱导尖端细胞显型和Dll4的表达，当抑制VEGF信号通路时，Dll4配体的表达量减少，因此，Notch1/Dll4信号通路可能是VEGF信号通路的下游细胞信号流，与VEGF共同调控血管萌发和分支的形态［25］。新生血管生成模型中，Dll4表达阳性的尖端细胞激活了相邻柄细胞的Notch信号通路以阻止血管进一步芽生［26］。即Notch1/Dll4信号通路激活相对于VEGF信号通路而言限制了尖端细胞的数量；反之，Notch1/Dll4信号通路抑制将导致尖端细胞的上升和柄细胞数量的下降［27］。随之引起的结果是血管密度的增加和新生血管的无节制芽生［28］。

3.4 Notch/Dll4信号通路与细胞外基质

Notch信号除调控血管生成而外，还参与调控细胞外基质分子的表达。小鼠胚胎在Dll4过度表达后，细胞外基质成分：纤维连接蛋白，层黏连蛋白和胶原蛋白等，在小鼠胚胎的背侧大动脉周围高度表达和聚集［29］。最近的研究揭示Notch通路还可以通过基底膜蛋白和整合素信号等细胞外基质上主动控制血管形态的发生［30］。这也从另一方面说明，Notch信号影响细胞外基质成分的生成和分布，具有稳定血管壁的作用，进而调控动静脉分化。

3.5 Notch通路与动静脉决定

以往认为，血液流动力学的调节是动静脉分化的决定因素，原因是只有分化成熟后的动静脉才能适应定向血流的压力［31］。但目前研究表明［32］，胚胎干细胞分化成内皮祖细胞后，决定其进一步分化为动脉或静脉内皮细胞的命运随即就由Notch信号参与。并且在动脉发育过程中，Notch信号抑制动脉向静脉表型的逆转分化。动脉的特异性标志EphrinB2是一种小分子跨膜蛋白，其受体EphB4为酪氨酸激酶受体仅表达于静脉系统，故通常作为静脉标记物。Notch信号通路大多成员的表达局限于动脉内皮部位［33］，当激活Notch信号后，EphrinB2基因被发现在静脉内皮细胞中异位表达。在斑马鱼中动脉内皮细胞分化以及形成适当大小和数目的动脉血管，Notch信号起至关重要的作用，阻断Notch3的结果是血管向动脉和静脉表型分化行为紊乱以及动脉和静脉血管畸形［34］。这些现象表明，动静脉表型的分化和维持均需要较高活性的Notch信号［35］。

3.6 Notch信号对血管生成后修饰

Notch信号通路不但调控哺乳动物的胚胎发育，而且也在维持成年个体组织器官的稳态中发挥重要作用［36］。在人体急性创伤或急性缺血再灌注损伤时，阻断Notch信号可以促进血管生成［37］。在血管形成后期，随着血管重塑及进一步稳定，Notch信号渐次失活，部分血管分支出现选择性退化，初级血管丛发育为具备层级关系的成熟血管网络，具备了正常功能。具体表现为断开血管分支连接，多余血管分支被剪除，结果是血管密度持续降低，内皮细胞重新恢复静止休眠状态等［38］。

4　问题与展望

近年来，国内外学者对Notch信号系统进行了多方面研究，尤其是Dll4/Notch信号与VEGF在血管生成过程中的作用进行了深入的阐述，但研究主要集中于对肿瘤的血管形成方面。而在组织移植再生血管化方面，研究的相对较少。尽管肿瘤在演进过程中血管的生成和移植组织再生血管化有相似的过程，但其根本区别在于肿瘤的血管生成是血管异常化并导致肿瘤局部环境的恶性变化［39］，而组织移植再生血管化则要求生成有功能的血管且有利于改善局部血供的主动行为。相信通过进一步的深入研究，借鉴肿瘤组织血管生成机制，有望在移植组织再生血管化方面取得颠覆性的进展。

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编辑/李阳利

The role of Notch signaling pathway in tissue vascularization

注：刘虎仙，北京解放军总医院在读博士

国家自然科学基金资助项目（81272123）

韩岩，主任、教授、主任医师；研究方向：组织移植、创伤修复及异体复合组织移植；E-mail:13720086335@163.com

2015-3-10

2015-4-13