富硒女贞子对奶牛血液指标和HSP70的影响

曹 铮，汤里平，姚秋霞，杨云乔，尚秋辰，许小琴

（扬州大学兽医学院，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）

奶牛热应激是一种主要由环境温度和空气湿度引起的全身适应性综合征，当奶牛机体受到超过自身体温调节能力的高温高湿刺激时，其下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴（HPA 轴）和交感－肾上腺髓质轴兴奋，从而产生一系列非特异性应答。

前期研究显示：富硒女贞子可以有效降低急性热应激小鼠的死亡率；减少热应激造成的小鼠生长抑制，提高其免疫力［5］；可有效的缓解热应激期间奶山羊的产奶量下降，增强奶山羊的抗氧化能力和免疫力；通过在热应激奶牛的日粮中添加富硒女贞子的研究发现，富硒女贞子高、中、低3个剂量组的奶产量较热应激前分别下降了23.91%、28.87%、25.23%，与普通女贞子组和热应激对照组分别下降的39.19%和36.55%有差异；饲喂中剂量富硒女贞子的试验2组和饲喂普通女贞子的试验4组的乳蛋白含量较热应激前也有提高。表明富硒女贞子具有良好的缓解热应激作用［6］。为进一步探究富硒女贞子对奶牛生理健康的影响和缓解热应激的机制，进行了如下试验观察。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 在扬州大学试验农牧场选择年龄、胎次相同，产奶量相近的中国荷斯坦奶牛40头，随机分为4组，每组10头，分别为：富硒女贞子高剂量组（1组）；富硒女贞子中剂量组（2组）；富硒女贞子低剂量组（3组）；普通女贞子组（4组）。

1.1.2 试验药物 女贞子均采自江苏扬州，并经鉴定符合女贞子药材特征。富硒女贞子，由扬州大学中兽医实验室自制，通过女贞树盛花期叶面喷施400mg／L浓度的亚硒酸钠2次，经生物转化法获得硒含量为1.88μg／g的富硒女贞子果实［7］。

1.1.3 试验仪器 中药粉碎机（天津泰斯特公司），干湿温度计，红外线体温计，TDZ4－WS台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪集团），BC－2800VET 血常规分析仪（迈瑞mindray），Centrifuge5810R 台式冷冻离心机（Eppendorf公司），一次性负压采血管（江苏荣业科技有限公司），核酸蛋白浓度检测仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验环境 40头试验用牛全部集中饲养在扬州大学试验农牧场5号双列牛舍中，每日上槽3次，时间分别是7∶00、15∶00和21∶00，各组基础日粮相同，精料根据上1d与前3d产奶量平均数而定量。将干湿温度计置于牛舍离地面1.5m高处，每天上午8∶00和下午15∶00读取温度和湿度，计算THI。

1.2.2 药物处理 将富硒女贞子和女贞子用中药粉碎机粉碎，过60 目筛，富硒女贞子分装为20g／包、40g／包、60g／包，女贞子分装成40g／包。

1.2.3 试验条件和给药方法 试验分两个阶段进行：第一阶段，2014年5月1日至2014年6月15日，各组均不给药，观察记录每天的气温和湿度，计算THI，并于试验开始的第1、15、30、45d的上午8时上槽前每组随机挑选6头奶牛使用一次性负压采血管进行尾静脉采血7 mL，其中2 mL 加入EDTA·K2抗凝管得到全血，5mL加入含有促凝剂的促凝管制备血清。全血在采血后2h内使用血常规分析仪进行血常规检测，血清使用EP 管分装后置于－20 ℃保存，用于血清生化指标检测。

第二阶段，2014年7月21日至2014年9月1日，于每旬的前三天下午15时给药，每日一次。给药剂量分别为1组60g／头／d、2组40g／头／d、3组20g／头／d富硒女贞子粉，4组40g／头／d普通女贞子粉。每天观察记录气温和湿度，并于试验开始的第1、15、30、45d的上午8时上槽前每组随机挑选6头奶牛使用一次性负压采血管进行尾静脉采血7mL，将2 mL 加入到EDTA·K2抗凝管得到全血，5mL加入到含有促凝剂的促凝管制备血清。全血在采血后2h内使用血常规分析仪进行血常规检测，血清使用EP管分装后置于－20℃保存，用于血清生化指标检测。

2.3.3 水源管理∶苗木扦插后当天对苗圃地及时上水是苗木成活的决定因子，注水采用灌注，第一次上水一定要足，以苗床表面有水为止；三天后第二次上水仍以苗床表面有水为度，让土壤吸足水分后风化；相隔5天后第三次上水，以苗床平水为度，以后灌溉以一个星期左右为宜，视天气情况而定，成活前只要保证苗圃地湿润为宜。

1.2.4 血常规和血清生化检测 血常规指标：使用BC－2800VET 血常规分析仪检测红细胞计数（RBC）、白细胞计数（WBC）、淋巴细胞计数（Lymph）、血红蛋白（HGB）含量4个指标。

血清指标：使用ELISA 试剂盒检测促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（Cortisol）、三碘甲腺原氨酸（T3）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、热应激休克蛋白（HSP70）、白介素6（IL－6）、γ－干扰素。试剂盒由上海酶联生物科技有限公司生产。

1.3 数据分析

试验所有数据均采用SPSS20.0统计软件，运用方差分析进行统计，结果以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 牛舍环境统计结果

统计试验期间每3d 的平均气温和湿度计算THI，由图1可以看出，7月21日到9月1日期间THI明显高于5月1日到6月15日这段时间，且均高于72，表明奶牛在7月21日到9月1日期间一直处于热应激状态。5月1日到6月15日期间，THI均在70以下，因此将第一阶段试验作为第二阶段试验的对照。

图1 牛舍温湿指数变化曲线图Fig.1 Changing curve of THI in cowshed

2.2 富硒女贞子对奶牛血常规指标的影响

从表1知，热应激期间（7.21～9.1）各组的的红细胞计数均呈下降趋势，但试验1、2两组与5.1到6.15期间的数据无显著差异（P＞0.05），3组显著下降（P＜0.05）。组与组之间，试验1组和2 组显著高于其他各组（P＜0.05）。

2.3 富硒女贞子对奶牛内分泌指标的影响

从表2知，热应激早期（用药前，7.21）ACTH含量上升，各组ACTH 水平自用药后（8.4）开始均有下降，其中试验1 组各时间段无显著差异（P＞0.05）。试验2、3、4组下降差异显著，其中试验2组的9.4数据较7.21数据有极显著下降（P＜0.01）。

表1 奶牛血常规测定结果Table 1 Results of routine blood examination of dairy cows

表2 奶牛血清内分泌指标测定结果table 2 Results of endocrine index of dairy cattle

奶牛血清中的皮质醇含量在慢性热应激状态下由于ACTH 的上升而上升，从表2知，试验1、3组在热应激期间（7.21～9.1）皮质醇含量无显著变化（P＞0.05）。试验2组用药后（8.4）皮质醇水平开始降低，较热应激初期（7.21）差异显著（P＜0.05），试验4组的皮质醇水平显著升高（P＜0.05）。

在热应激早期（7.21），各组奶牛血清中T3 水平均较非热应激期间有大幅下降，其中1、3、4组差异显著（P＜0.05）。用药之后，各组的T3水平均有所上升，其中试验1，2、4组与在试验结束时（THI＞75）恢复到正常时（THI＜70）的T3水平，试验3组的T3水平上升后下降，在试验结束时仍有显著低于正常值（P＜0.05），药效果不明显。

2.4 富硒女贞子对血清中热休克蛋白含量的影响

从表3可看出，各组均能增加热应激状态的奶牛血清中HSP70的含量，其中试验1、2组HSP70在用药后含量最高，与其他各组有显著差异（P＜0.05）。从时间上比较，试验1、2组HSP70水平均呈上升趋势，但1 组各个时间段无显著差异（P＜0.05），2组较喂药前（7.21）有显著提高（P＜0.05）。

2.5 富硒女贞子对奶牛抗氧化性能的影响

从表4知，在试验过程中各组的SOD 值均有所上升，其中试验2组和4组差异显著（P＜0.05），其他各组均无显著差异。

表4 中GSH－PX 的结果显示，在热应激状态中，奶牛血清中的GSH－PX 含量会下降（5.1～6.15和7.21 比）。在热应激期间试验2 组和4 组的GSH－PX含量较喂药前（7.21）有显著提高（P＜0.05）。其他各组无显著差异（P＞0.05）。

表3 奶牛血清中HSP70测定结果table 3 Effects of se－enriched ligustrum lucidum fruits on HSP70of dairy cattle

表4 奶牛抗氧化性能测定结果table 4 Results of antioxidant capacity examination of dairy cattle

2.6 富硒女贞子对奶牛免疫指标的影响

从表5可以看出，用药之后（7.22）奶牛血清中白介素6水平均呈上升趋势，其中除试验2组、4组外均有上升（P＜0.05）。组间比较可以看出，在8月18日时试验2、3 两组IL－6 含量高于试验1、4组，但差异不显著（P＜0.05）。

从表4可看出，奶牛血清中IFN－γ水平在7月21日后，试验1、2、4组均迅速上升，均较5.1～6.15数据有显著提高（P＜0.05），其中试验2组差异极显著（P＜0.01），试验3组用药后IFN－γ水平较用药前有所上升，但差异不显著（P＞0.05）。

表5 奶牛免疫指标检测结果table 5 Results of immune indices examination of dairy cattle

3 讨论

奶牛所经历的环境和管理条件（如过热、拥挤、运输、接种疫苗等）具有激活下丘脑－垂体－肾上腺皮质（HPA）轴和交感－肾上腺髓质轴的潜在能力，这些条件被称为应激物［8］。在本次试验中，热应激时（7.22）各组的ACTH 和皮质醇水平较正常状态（5.1～6.15）下为高，而T3 水平有所降低，与蔡亚非等［9］和Selberg等［10］对荷斯坦奶牛的研究结果相一致，这是因为高温作为应激物使HPA 轴兴奋，使促肾上腺皮质素释放激素（CRH）分泌增加，从而使ACTH 分泌亦增加，皮质醇受ACTH 调节上升［11］。与此同时，动物体内自身调节降低代谢率以降低代谢热，所以，在热应激期间奶牛的T3 水平有所下降。在用药后（8.4、8.18、9.1）各组的ACTH 水平均有所下降，其中试验2组效果最为明显，在试验结束时较热应激期间有极显著下降。皮质醇方面，在用药后除试验4组外各组均无显著差异。表明富硒女贞子和女贞子具有通过降低ACTH 水平而调节奶牛抗热应激的功能。

1957年，Schwarz［12］发现硒是哺乳动物所必需的营养素，改变了此前人们对硒的看法。1973年Rotrku［13］的研究发现硒是GSH－Px 的组成成分。GSH－Px可以在生物体内催化氢过氧化物或脂质过氧化物转变为水或醇类，消除自由基对生物膜的攻击，保护生物膜免受氧化损伤。硒能够调节维生素C、维生素E 的吸收和利用。且硒能够改善奶牛的瘤胃内环境使乙酸、丙酸、丁酸及挥发性脂肪酸（VFA）的总产量同时提高［14］。试验中各组在热应激早期（7.21.～8.4）SOD 和GSH－Px 水平均下降，与宋小珍等［15］观察到热应激期间锦江黄牛的SOD 和GSH－Px水平下降的结果相一致。这主要是由于热应激使奶牛的交感－肾上腺系统兴奋从而导致肾上腺髓质大量分泌儿茶酚胺类激素使自由基产生量增加，进而产生组织内脂质过氧化作用，使体内储备的酶类和非酶类抗氧化剂因消耗过多而水平下降［16］。用药后试验2组和4组的SOD 和GSHPx水平均有上升（P＜0.05），且试验2组的GSHPx水平较4组为高。表明富硒女贞子和女贞子具有良好的提高动物机体抗氧化性的能力，且中剂量富硒女贞子作用更好。

由热应激诱导产生的热应激蛋白（HSPs）通过分子伴侣作用参与蛋白质折叠、转运、细胞保护、抗原递呈及肿瘤免疫等许多重要体内过程。热应激蛋白按分子量大小可以分为HSP100、HSP90、HSP 70、HSP60及小分子HSP，其中被研究最多也最为重要的是HSP70家族。真核生物HSP70的转录需要通过：热应激转录因子（HSF）的激活，HSF 与热应激元件（HSE）的组合，HSP70基因的转录三个步骤。正常状态下HSF 与HSP70 结合，不具有与HSE结合的能力，在应激条件下，损伤的蛋白与HSP70竞争性结合，使HSF游离出来结合HSE 促进HSP70基因的转录［17］。在翻译时，HSP70 mR NA 通过增强稳定性和优先翻译来保证机体的需要。许生友等［18］在研究热应激期间肉鸡肝脏和下丘脑HSP70mRNA 表达时发现，在动物刚出现热应激反应时，体内HSP70mRNA 的表达量上升，随着热应激时间的增长，表达量迅速下降，表明高温超出了动物本身的调节能力。本次试验中，在用药前（7.21）HSP70含量较正常时期有大幅下降，用药后开始回升，这与张洪德等［19］使用白虎汤加减进行的研究结果相似。

应激对免疫系统的抑制性影响目前受到了人们的广泛重视，其中包括淋巴细胞活性降低，干扰素产生减少，吞噬作用降低，NK 细胞活性减低，辅助性T 细胞和抑制性T 细胞百分数及比率降低，唾液IgA 水平降低等［20］。应激与免疫是通过神经内分泌系统相联系的，应激引起HPA 轴反应，导致各种激素分泌亢进，这些激素作用于细胞因子，从而影响免疫功能。胡艳欣等［21］对热应激后猪血清的IFNγ测定结果表明，热应激会导致动物体内IFN－γ分泌量大幅下降。本次试验中，用药后IL－6与IFN－γ水平能显著上升，表现出了富硒女贞子对热应激的免疫系统抑制性影响有较好的治疗效果。

4 小结

试验证明富硒女贞子可以改善内分泌，有效地降低ACTH 和皮质醇水平，升高T3 水平；诱导HSP70表达，使血清中HSP70的水平升高；增强抗氧化能力，使SOD 和GSH－Px活性升高；提高IL－6和IFN－γ表达量，增加免疫力。通过这些途径来缓解、治疗奶牛的热应激反应。但是，进一步分析试验结果看出，富硒女贞子60、40、20g／头／d的剂量的作用效果在不同观察指标间存在一定的差异，其最佳剂量、疗程还有待进一步研究；富硒女贞子中发挥这些作用效果的有效成分亦有待探讨。

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