牛科物种β－酪蛋白基因的研究进展

薛 杰，苗永旺

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

牛科动物乳中各成分的含量比较稳定，乳蛋白约占乳中干物质的90%。乳蛋白通常分为两大类，一类是酪蛋白，主要包括αs1－酪蛋白（CSN1S1）、αs2－酪蛋白（CSN1S2）、β－酪蛋白（Beta－casein，CSN2）、γ酪蛋白和k－酪蛋白（CSN3），其中γ酪蛋白是β酪蛋白的水解片段；另一类为乳清蛋白，包括α－乳清蛋白和β－乳球蛋白以及少量的乳铁蛋白。哺乳动物乳汁中蛋白质含量为30～35g／L，一头奶牛每天可以产乳蛋白1kg，一只奶山羊可产乳蛋白200g。牛奶含氮物在（pH＝4.6）等电点沉淀的部分即为酪蛋白。酪蛋白是牛羊奶中的主要蛋白质，占奶总蛋白质的80%，乳中主要的酪蛋白是CSN1S1和CSN2。普通牛奶中CSN2约占全酪蛋白的35%［1］，仅次于CSN1S1，而CSN2在山羊和人乳中的含量为最高，在山羊奶中占到酪蛋白的54%以上，在人奶中则达到70%。CSN2在奶牛乳中含量约为9g／L；水牛奶中约为14.2g／L；在山羊乳中约为10g／L［2］。

β－酪蛋白在各种哺乳动物的乳汁中都占有相当大的比例，且都是其主要的蛋白质。这表明在泌乳激素的刺激下，β－酪蛋白基因具有很强的表达活性。因此，深入探讨β－酪蛋白基因，对推动动物产奶性状的选育和转基因药物的开发具有重要的意义。

1 CSN2生物学特性及其合成机制

酪蛋白是典型的含磷蛋白质，为白色无味物质，也是形成牛乳白色状的主要成分。酪蛋白分子具有亲水性层和疏水性层双重特性，为两性分子。酪蛋白在动物乳腺中高水平表达，在乳中以微团形式存在，其主要作用是可与Ca2＋形成螯合物，并转运至新生儿的骨骼中促进骨骼的发育。酪蛋白含有几乎全部的必需氨基酸，尤其富含脯氨酸，它是幼年家畜中最具营养价值的蛋白质，并在肠中矿物质（Ca、P、Zn、Fe、Na等）的吸收、炎症反应和免疫调控等方面也有重要的作用［3］。β－酪蛋白为牛科物种乳蛋白中含量较高的蛋白质，是在哺乳期通过产生类固醇激素刺激乳腺分泌合成的，CSN2与其它3 种酪蛋白在乳中以酪蛋白胶团的形式存在，成胶体状，具有较强的疏水性，β－酪蛋白在普通牛中分子重约为25.147KDa，常温下微溶于水，等电点为5.430，在中性环境下（pH＝7），电荷量为－6.088。β－酪蛋白相比其他酪蛋白含有大量的脯氨酸残基，不含半胱氨基酸残基，N－末端带负电荷，且在其附近形成了主要的磷酸化作用位点。CSN2基因是酪蛋白基因家族中的一员，CSN2 与CSN1S1 和CSN1S2 统称为钙敏感蛋白，可与磷酸钙形成稳定完整的微胶粒而提高乳中钙、磷含量。除此之外，CSN2可用于奶酪的制做，并且对牛、羊乳的凝固发挥着重要的作用。乳中CSN2 含量稳定，因此，可以利用乳中CSN2的含量来检测牛、羊乳样品是否掺假［4］。

乳腺是合成蛋白质十分活跃的场所，乳蛋白编码基因的表达具有明显的组织特异性。除此之外，乳蛋白基因的表达还受神经内分泌的调控。CSN2与其他乳蛋白合成机制相同，对于乳蛋白的合成机制，Boisgard等［5］于2000年做了研究。乳蛋白首先是在内质网的核糖体上开始运作，然后由信号肽引导进入内质网腔，接着与高尔基体短暂结合，且在转运前集中于高尔基体后的分泌囊泡。未成熟的蛋白质在内质网和高尔基体内进行磷酸化和糖基化等化学修饰过程，再由高尔基体分泌囊泡转送至上皮细胞顶膜，此期间即形成酪蛋白。近年来研究表明，JAK2－STAT5、AKT1－mTOR信号途径是乳蛋白的重要信号途径，从基因表达和蛋白质合成水平调控乳成分的合成与分泌。Zhou 等［6］2008年研究发现，通过对GHR 和STAT5基因在奶牛乳腺上皮细胞中进行超表达，放大生长激素的作用，β－酪蛋白的mRNA 表达上升，证实生长激素可通过STAT5影响乳蛋白的表达。Hayashi等［7］在2009年报道了通过对奶牛皮下注射生长激素，β－酪蛋白产量与对照组相比明显上升，试验结果表明生长激素可刺激mTOR 信号通路使其激活。同样IGF－1R 激活AKT1－mTOR信号途径，也使牛乳腺上皮细胞乳蛋白的合成增加。

2 牛科物种CSN2基因结构

2.1 普通牛CSN2基因结构

Stewart和Jimenez－Flores等在1987年确定了普通牛CSN2＊A2型的cDNA 序列，Bonsing等［8］于1988年确定了普通牛CSN2＊A2 型的基因序列［8］。在普通牛中，CSN2 基因（登录号：AC＿000163）全长8 693bp，共包含9 个外显子，8 个内含子，基因结构如图1所示。牛CSN2基因9个外显子长度范围为24～498bp，外显子1的前123bp位于5′UTR 区，外显子2至外显子7的长度分别为63bp、27bp、27bp、24bp、42bp和498bp，外显子8的后36bp和外显子9的全部位于3′UTR 区，其中外显子7 长498 bp，占整个编码区约70%。CSN2的8个内含子长度范围为91～1 956bp，内含子1至内含子8 分别为1 956bp、727bp、112bp、1 893bp、9 1bp、1 3 2 1bp、6 0 1bp和7 3 0bp。在此CSN2基因启动子区域发现存在多种转录因子结合位点，如STAT（MGF）、C／EBP、CAAT box与TATA box等。CSN2基因（登录号：M55158）CDS区长675bp，编码一条由224个氨基酸组成的成熟多肽链，其中前15个氨基酸为信号肽序列。该基因编码区包含24.15% A、20.14% G、25.04%T、30.67%C，其中 AT 含量为49.19%，CG 为50.81%，解链温度为84.99。

图1 普通牛CSN2基因结构图Fig.1 CSN2gene structure map of ordinary ox

2.2 水牛CSN2基因结构

水牛CSN2的cDNA 序列于1998年公布，而它的基因序列于2009年在意大利地中海水牛中被报道［9］。水牛CSN2 基因全长10.2kb，基因结构与普通牛相似，也由9个外显子和8个内含子组成，水牛CSN2基因各外显子长度与普通牛相比一样，内含子略有不同，5′UTR区与3′UTR 区序列长度也相似，所有剪切位点都遵随5′GT／3′AG 法则。水牛CSN2的cDNA 序列（登录号：DQ631829）包含23.85%A、20.59%G、24.89%T 和30.67%C，其中AT 含量为48.74%，GC 为51.26%，解链温度为85.18。

2.3 山羊CSN2基因结构

王强等［10］于2001年公布了山羊的CSN2的全基因序列。山羊CSN2基因全长13 671bp，基因结构与普通牛和水牛相似，也由9个外显子，8个内含子组成。其中第1、第7和第9外显子长度与普通牛和水牛略有不同，其它外显子长度都相同，山羊第1、第7和第9外显子长度分别为48bp、495bp和323bp。山羊CDS序列（登录号：AF409096）碱基组成为24.70%A、20.54%G、24.85%T 和29.91%C，AT 含量为49.55%，GC50.45%，解链温度为84.84。

目前，在NCBI数据库中可检索到普通牛、水牛、山羊、绵羊、羊驼等牛科物种及人、长臂猿、猩猩、骆驼、家猪、猕猴、兔子和小鼠等哺乳动物的CSN2基因序列，通过序列比对发现牛科物种间序列一致性较高，普通牛与水牛相似度高达98%，而与其他牛科物种和哺乳动物的CSN2 氨基酸序列相似度约为96%。在不同物种中，CSN2的氨基酸数量组成存在差异，这种差异可能是由于种间水平的差异造成的。

3 牛科物种CSN2基因变异

3.1 普通牛中发现的CSN2基因变异类型

迄今，在普通牛CSN2基因中发现13种不同的遗传变体，分别为A1，A2，A3，A4，B，C，D，E，F，G，H1，H2，I。在奶牛中，CSN2 类型最常见的形式为A1和A2，而B 型是很少见的，A3 和C 是更少见［8］，CSN2＊A2类型是原有的形式，为定义其他类型的参考蛋白。A4等位基因虽然已在韩国本地牛群中发现，但是以A2为参考蛋白的替换，目前还不清楚。Eigel等［1］于1984年阐述了CSN2的7个等位基因A1、A2、A3、B、C、D、E，即A1 蛋白为原有A2型肽链的67 位Pro→His替换导致的变异体；A3蛋白为A2型的106位His→Gln替换；B 蛋白在保持A1 蛋白的基础上，为122 位发生了Ser→Arg替换；C蛋白也同样发生在A1蛋白的基础上，35位的丝氨酸发生了去磷酸化（SerP→Ser），同时37位发生了Glu→Lys替换；D 蛋白是A2型的18位发生了SerP→Lys改变；E 型则为A2型的36位Glu 替换为Lys。Visser 等［11］于1995年发现了CSN2＊F，该蛋白是在A1型变体的基础上，152位氨基酸发生了Pro→Leu替换。Dong和Ng－Kwai－Hang［12］在1998年发现了CSN2＊G，它和CSN2＊F变异相似，但在137或138位发生了Pro→Leu替换。Han等［13］在2000年发现了CSN2＊H 有2个突变，命名为H1型，为A2型的25位发生了Arg→Cys替换，88位发生Leu→Ile替换；Senocq等［14］于2002年发现了另一种H 型突变，命名为H2，它不同于H1型，为A2型的72位发生Gln→Glu替换，93位发生Met→Leu替换和在114与169间发生了Gln→Glu 的替换。Jann 等［15］于2002年发现了I型变异体，它仅仅包含H2 型的93 位氨基酸发生Met→Leu 替换。Givens等［16］2013年在英国零售牛奶研究中发现CSN2基因有A1、A2、B、C 等4种变异类型。

3.2 水牛中发现的CSN2基因变异

有关水牛的CSN2 基因变异很少被报道。Bhattacharya等［17］于2008年报道了水牛CSN2基因和普通牛相比有6个氨基酸改变，分别为第4位、第56位、第83位、第107位、第121位和第163位氨基酸发生了His→Arg、Met→Thr、Lys→Asn、Ile→Val、His→Gln 和Pro→His替换；Cosenza等［9］于2009年报道了意大利地中海水牛的CSN2基因结构，通过比较所获得外显子的序列与已发表的水牛序列，发现存在13个突变，其中3个为非同义突变，发生在外显子7的第20，78，179核苷酸位点，分别为T→A（Ile→Asn）替换，G→C（Lys→Asn）替换和T→C（Met→Thr）替换。Vinesh等［18］2013年发现在水牛CSN2基因外显子7存在2个单倍型和启动子区有4个单倍型。

3.3 山羊中发现的CSN2基因变异类型

截至目前，在山羊CSN2基因中发现9个等位基因，分别为A、A1、B、C、C1、D、E、0、01。其中A、A1、C、C1、E、0和01等7个是在DNA 水平发现的，B和D2个类型由蛋白质水平检出。山羊的CSN2＊A 型基因为定义所有突变类型的参考序列。Mahe等［19］在1993年通过等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）电泳技术发现了CSN2＊B 型基因的突变；Neveu等［20］于2002年发现了0和01两个不同的等位基因，CSN2＊0型为A 型基因外显子7在5′端一个核苷酸的缺失所导致，CSN2＊01为A 型基因外显子7的一个C→T 核苷酸替换（125 位密码子）产生终止密码，导致蛋白翻译提前终止；Galliano等［21］在2004年报道了CSN2＊D型基因的突变；Cosenza等［22］于2005年在山羊中检测出了一个等位基因CSN2＊A1，它是在外显子9的第180位核苷酸发生了C→T 转换；Chessa等［23］于2005年发现在A型基因外显子7上第135位核苷酸有C→T 的转换，氨基酸替换为Ala→Val，该变异命名为CSN2＊C型基因；Caroli等［24］在2006年检测出了等位基因CSN2＊E，它发生在A 型基因外显子7上第124位核苷酸C→A 的转换，即该A 型蛋白166位氨基酸的Ser→Tyr 替换；Chessa等［25］于2008年又发现了等位基因CSN2＊C1，它是在CSN2＊C基因的基础上，外显子9的第60位核苷酸发生C→T的替换。

4 CSN2基因与生产性状的关联性

CSN2基因在牛科物种中有多种变异类型，国外学者对CSN2 基因与生产性状的关联研究已有一些报道，然而国内还未曾见有相关研究的报道。该蛋白现已经在普通牛与山羊中有一些研究报道，但在水牛中的研究报道很少。近年来关于CSN2基因与生产性状关联研究如表1所示。

5 CSN2基因研究的问题及其展望

众多研究结果表明，CSN2基因与牛科物种的生产性状存在一定的相关性，但当前在CSN2基因的研究和应用中仍存在一些不足，在未来亟待进一步解决：①在牛科物种的研究中涉及水牛和绵羊等物种较少，应加强此类动物的研究；②影响牛科物种泌乳性状的各基因之间存在连锁，有些与生产性状的关联可能是由于CSN2连锁基因的效应而并非它本身的效应，因此在接下来的工作中需阐明此影响机制；③多数研究针对于牛科物种基因编码区的变异检测，而对其5′端、3′端和内含子等区域的调控机制研究较少，可加强这方面研究，以解析其转录调控的分子机制；④对CSN2的探索多集中于基因变异的检测，而对基因的磷酸化水平、糖基化程度、转录后水平的修饰等研究较少，应加强此方面的研究；⑤有关CSN2基因的表达调控机制尚不十分清楚。

表1 CSN2基因与生产性状关联研究Table 1 CSN2Gene associated with production traits

牛科物种β－酪蛋白作为乳中重要的酪蛋白之一，对乳的理化特性和品质具有重要影响。同时，CSN2在乳的营养功能方面扮演重要角色。目前，对一些牛科物种CSN2 基因多态性已有一些研究报道，但对CSN2 基因的变异、表达调控机制及其多态性与生产性状、奶制品品质之间的关联性等研究的还不充分，急需深入研究，为奶用性状的遗传改良提供分子基础。

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