宫颈癌术前动脉灌注化疗对淋巴转移的影响及可能机制的研究

张蕾 徐丛剑 姜桦

宫颈癌术前动脉灌注化疗已在临床应用了近半个世纪，其近期疗效显著，但远期疗效仍存在争议，至今仍未进入FIGO推荐的治疗方法中，其原因有待深入研究。淋巴转移是影响远期疗效的最重要因素，CD44是细胞黏附因子中与宫颈癌淋巴转移密切相关的一种。其变异型CD44V6阳性者有如下表现:血管浸润的发生明显增加;淋巴结转移率增加，受累数目增多;无复发生存期缩短，5年生存率下降［1，2］。本研究采用病史回顾性研究结合体外试验real-time PCR法测定宫颈癌Hela细胞CD44表达，初步推测宫颈癌术前灌注化疗的远期疗效存在争议的原因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2001至2007年复旦大学附属妇产科医院确诊宫颈鳞癌(腺癌)Ⅰb～Ⅱb期患者722例，年龄24～73岁，平均年龄41.6岁。宫颈癌分期按FIGO(2000年)标准。

1.2 方法 对722例宫颈癌患者的临床资料进行回顾性分析，按FIGO(2000年)分期，Ⅰb期543例，Ⅱa期139例，Ⅱb期40例。按其不同治疗方式分为先行术前动脉灌注再行手术组与直接手术组。术前灌注化疗后再行手术患者186例。动脉灌注化疗药物中，使用顺铂+长春新碱+吡柔比星方案5例;PVB(顺铂+长春新碱+博莱霉素)方案2例;顺铂+表阿霉素+博莱霉素方案179例。动脉灌注化疗1次165例，2次者20例，动脉灌注化疗后加用化疗一次1例。直接手术组536例。术前动脉灌注化疗后1个月手术。手术方式均为广泛全子宫切除+盆腔淋巴结清扫(伴或不伴双附件切除)。

1.3 短时间的顺铂作用Hela细胞后对其细胞黏附因子CD44表达的影响

1.3.1 主要仪器与试剂:GeneAmp system PCR2400(美国PE公司产品);Thermal Cycler Dice Real Time System扩增议(Perkin Elmer公司，美国);PCR仪(Perkin Elmer公司，美国);顺铂(SIGMA公司产品);RNAiso Reagent(Takara公司);real-time试剂(SYBR PrimeScript RT-PCR Kit Takara公司)。

1.3.2 引物设计合成 CD44引物由 TaKaRa公司设计，序列如下:正义引物 5’-GCTTCCAGAGTTACGCCCTTGA-3，反义引物 5’-AACCCTTGCAACATTGCCTGA-3;内参照β-actin正义引物 5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，反 义 引 物 5’-CAAACATGATCT GGGTCATCTTCTC-3’。

1.3.3 选取顺铂浓度:用四氮唑盐法(MTT法)检测不同浓度含顺铂培养液(0 mmol/L，0.005 mmol/L，0.05 mmol/L，0.5 mmol/L，5 mmol/L)在不同时间(4.5 h，9 h，18 h，36 h，72 h)作用下细胞活性。并绘制细胞生长曲线。

1.3.4 分组:根据上述试验结果，取顺铂浓度0.05 mmol/L。将Hela细胞分3组进行试验，分别为正常Hela细胞组、顺铂持续作用Hela细胞组、顺铂作用6 h后撤药更换正常培液组。RNA提取时间点均采取0 h，4 h，8 h，16 h，24 h，32 h(顺铂作用 6 h 后撤药组以撤药时间为0点)。

1.3.5 提取细胞RNA收集规定时间点细胞，PBS清洗沉淀，加入RNAiso Reagent 1 ml后匀浆，加入氯仿200 μl震荡混匀后静置，离心后取上层加入异丙醇。离心并将沉淀用75%乙醇洗涤再次离心后干燥，加DEPC水溶解。

1.3.6 总DNA纯度鉴定 制备得到的RNA通过分光广度仪测得 D260nm/D280nm 在1.8～2.1。

1.3.7 总cDNA合成 采用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit试剂盒合成 cDNA，取总 RNA(所取量按 OD浓度)，加入 4 μl 5 × PrimeScript Buffer、1 μl PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μl Oligo dT Primer、1 μl Random 6 mers，加 RNase Free dH2O 使总样本体积达 20 μl。37℃孵育15 min，然后85℃孵育5 s，置于－20℃冰箱保存。

1.3.8 实时定量荧光PCR取提取细胞及β-actin模版(cDNA 溶液)6 μl，加入 0.5 μl PCR Reverse Primer、0.5 μl PCR Forward Primer、12.5 μl SYBR Premix Ex Taq，加dH2O至样本体积达25 μl。反应过程:预变性Repeat 1 95℃ 10 s;PCR 反应 Repeat 40 95℃ 5 s、60℃30 s，反应完毕。

1.4 统计学分析 应用stata 7.0统计软件，用相对定量研究方法分析实验结果。根据扩增曲线，确定每个基因相应的 Ct值 ，进行相对定量研究和统计处理。以β-actin为阳性内对照基因，校正PCR模板的拷贝数。相对量采用2－ΔΔCt方法计算，即ΔCt目标基因－Ct目标基因 －Ct同一样本 β-actin;ΔΔCt目标基因=处理组 ΔCt目标基因-对照组 ΔCt目标基因 ，而相对倍数 (Relative Quantification)=2－ΔΔCt目标基因。计数资料采用χ2检验及Fisher确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前动脉灌注后手术与直接手术组脉管内癌栓发生率比较 Ⅱa期术前动脉灌注组脉管内癌栓率16.7%，低于直接手术组34.2%，差异有统计学意义(P＜0.05)，术前动脉灌注组总脉管内癌栓发生率17.7%，低于直接手术组27.6%，差异有统计学意义(P＜0.05)。Ⅰb期、Ⅱb期2组比较无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

表1 宫颈癌Ⅰb～Ⅱb患者脉管内癌栓发生率比较例(%)

2.2 术前动脉灌注后手术与直接手术组淋巴转移率比较 术前动脉灌注组总淋巴转移率16.1%，高于直接手术组9.9%，2组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Ⅰb期、Ⅱa、Ⅱb期差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表 2。

表2 宫颈癌Ⅰb～Ⅱb患者淋巴转移发生率比较 例(%)

2.3 短时间的顺铂作用Hela细胞后对其细胞黏附因子CD44表达的影响

2.3.1 目的基因及管家基因的标准曲线:目的基因与管家基因的质粒标准品分别以10倍等比稀释(稀释成6个浓度)后做定量PCR，所得到的Ct值与不同浓度标准品的对数值之间具有良好的线性关系，并拟合得出标准曲线。CD44的相关系数为0.999，β-actin的相关系数为0.999。见图1。

图1 CD44和β-actin的标准曲线

2.3.2 顺铂持续不同时间作用于Hela细胞后，残留活细胞CD44表达的改变:共分为3组:正常不加顺铂的Hela细胞，顺铂持续作用的Hela细胞，顺铂作用6 h后撤药的Hela细胞。在32 h内定点测定其CD44表达，了解其改变趋势。见表3～5。

表3 顺铂持续作用CD44表达量

表4 正常Hela细胞随时间改变CD44表达

表5 顺铂作用6 h撤药后CD44表达

2.3.3 CD44表达水平:顺铂持续作用组＜正常Hela细胞组＜顺铂作用6 h后撤药组;Hela细胞黏附因子CD44分泌呈波动性。正常Hela细胞CD44表达水平波动较平缓;顺铂持续作用后，CD44表达波动频率增大;顺铂作用6 h后撤药组，CD44表达波动振幅最大。见图2。

图2 顺铂持续、短时作用CD44表达的比较

2.3.4 CD44和β-actin的溶解曲线及扩增曲线:样本及内参的溶解曲线和增值曲线，非特异性增值少，且溶解峰均为单峰。试验具有稳定性。见图3。

3 讨论

图3 溶解曲线和增值曲线

宫颈癌的动脉灌注化疗作为一项新的有效治疗宫颈癌的手段，在宫颈癌的治疗中占着重要的地位。动脉灌注化疗是将抗癌药物通过动脉血管注入到靶器官，达到治疗肿瘤的目的。其优势在于首过效应，即当抗癌药物进入体内时首先接触的组织器官优先摄取药物，从而产生最大的生物学效应。研究发现:(1)在灌注后组织药物浓度方面:动脉化疗高于静脉化疗;(2)在用药途径方面:子宫动脉化疗优于髂内动脉化疗;(3)在用药量方面:随着抗癌药物剂量的升高，癌组织内抗癌药物的量呈几何倍数升高。动脉灌注化疗的近期疗效已经被多次证实，Kobayashi等［3，4］曾通过研究证明动脉内灌注化疗前应用能有效的缩小肿瘤。但在动脉灌注化疗的远期疗效方面，却没有统一的结果。日本学者Takafumi Toita在97年曾行宫颈癌患者的流行病学调查，选取51例宫颈癌Ⅱb～Ⅳa行顺铂动脉内灌注化疗及放疗患者，结果显示术前动脉灌注化疗对远期的疗效并不明显［6］。Kigawa 等［7，8］所作的研究也得到相同结果。但也有Yamakawa等［9］发现Ⅲb期介入后能手术者4年无瘤生存率75.2%，而放疗仅为44.4%，差异显著。以上研究得出了不同的结论，值得进一步研究。

淋巴转移是浸润性宫颈癌的主要扩散方式。FIGO临床分期和淋巴结转移为宫颈癌预后独立危险因素。脉管内癌栓是影响预后的一项重要因素，但不影响肿瘤的分期。所以本研究选取了淋巴转移率来评估术前动脉灌注化疗的远期疗效。同时，选取脉管内癌栓发生率，来评估术前动脉灌注化疗对局部肿瘤的疗效。

从分析结果来看，术前动脉灌注化疗组的脉管内癌栓发生率相对于直接手术组总体脉管内癌栓发生率下降，Ⅱa期脉管内癌栓发生率下降，Ⅰb期与Ⅱb期无显著性差异。各期淋巴转移率无显著性差异，总体淋巴转移率上升。该结果提示术前动脉灌注化疗确实能局部缩小癌灶，因此能减少脉管内癌栓的发生，但淋巴转移率增加的结果，提示其对于远处转移没有作用，甚至增加了远处转移的风险［10］。这与其他学者所作的关于改善预后效果并不明显的研究相符。2组Ⅱb期脉管内癌栓发生率和淋巴转移率没有显著性差异可能与病例例数较少有关。基于这个结果，本研究继续行体外细胞试验，做进一步研究。

细胞黏附因子(CAMs)是介导细胞与细胞间或细胞与基质间或相互接触和结合的一类因子，分布于细胞表面或细胞外基质(ECM)中，导致细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞之间的黏附，参与细胞的信号转导与活化等系列重要生理和病理的过程。CD44是在肿瘤转移中起重要作用的细胞黏附因子，通过内皮和内皮下间质来介导肿瘤细胞间的相互作用，表达于各种组织细胞中:淋巴细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞等，在宫颈癌的分化、浸润及转移过程中起重要的作用。对早期预测肿瘤的侵袭和评估预后是一种良好的指标，已得到国内外大量研究证实。主要功能有:(1)参与淋巴细胞归巢的过程;(2)参与淋巴细胞激活的过程;(3)与透明质酸结合、介导细胞基质间的粘连;(4)影响细胞迁移过程［9，11］。可与 EGF受体HER2相互作用，致使细胞分裂增值失控，促进肿瘤进展。其表达量与肿瘤细胞的黏附能力成正比。

本研究旨在模拟宫颈癌术前灌注化疗模式，选取目前动脉灌注化疗常用药物顺铂，短时间作用于宫颈癌Hela细胞(6 h)后撤除药物，与顺铂持续作用的Hela细胞及无药物作用的Hela细胞比较，观察其CD44黏附因子表达的改变。不加药的正常Hela细胞CD44分泌水平随时间改变变化不大，呈较稳定趋势。加入顺铂持续作用后，CD44表达水平下降，但分泌的波动性增加，CD44水平并没有随药物作用时间增长而持续降低，呈波动性稳定在一个较低水平。可能顺铂作用后，残留的细胞能稳定在同一浓度顺铂环境下生长，但数量被抑制，所以CD44水平虽然波动，但仍维持在一个较低水平，且波动存在一定节律性。当顺铂作用6 h撤药后，正常培养液继续培养的Hela细胞CD44水平明显增高，波动幅度增大，撤除药物作用的宫颈癌细胞CD44的分泌呈反跳性的增高，黏附能力增强，此时的癌细胞更易于从原发灶脱落转移，当这部分癌细胞转移后，由于短时顺铂作用已经消失，没有后续药物继续作用，癌细胞活性恢复，在转移处能稳定生长，增加了宫颈癌转移的可能性。所模拟的术前灌注化疗，可能正是由于一过性化疗药物作用于局部宫颈癌细胞后，导致宫颈癌细胞细胞黏附因子分泌增加，转移可能增大。该结果可能提示了术前灌注化疗后，淋巴转移率升高的原因。

本研究从临床流行病学和体外细胞学试验两方面，初步证实了宫颈癌的术前灌注化疗在缩小局部病灶的同时，可能会增加远处转移的风险。提示临床使用术前灌注化疗，行手术后，可能仍需加用化疗药物治疗。

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6 Takafumi Toita.Therapeutic value of neoadjuvant intra-arterial chemotherapy(cisplatin)and irradiation for locally advanced uterine cervical cancer.Gynecol Oncol，1997，65:421-424.

7 Kigawa J，Minagawa Y，Ishihara H，et al.The role of neoadjuvant intraaterial infusion chemotherapy with cisplatin and bleomycin for locally advanced cervical cancer.An JClin Oncol，1996，19:255-259.

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