含L-精氨酸库存血对大鼠红细胞的影响及对离体血管调节作用的研究

卢志芬 曹俊霞

L-精氨酸(L-Arg)为一种碱性氨基酸，可参与体内的多种代谢过程，其中L-Arg作为底物可生成NO，能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，减少栓塞的发生;L-Arg还有类似硝酸脂类药的作用，对于离体的血管具有调节其舒张功能的作用，特别是对冠状动脉血管的作用更为明显。而NO对于改善休克后行输血治疗过程中血管应激性损伤作用显著且可靠，因此，L-Arg可能通过改善库存血中NO浓度进而调节患者机体血管功能。本实验主要研究库存血中加入L-Arg后，对大鼠血管功能的调节作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 3个月左右的SD大鼠，其中雄体10只，雌体10只;体重300～400 g，大鼠饲养盒外部温度18～26℃，相对湿度40% ～70%，盒内温度比外部环境高1～2℃，温度高5% ～10%，噪音85分贝以下，氨浓度20 PPm以下，通风换气8～12次/h，添加饲料2次/周，换水2～3次/周，换窝1～2次/周，由中国军事医学科学院实验动物中心提供。经中国军事医学科学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验材料

1.2.1 仪器及试剂:ABL735血气分析仪及配套试剂(丹麦，Radiometer公司);BV-100悬丝流变仪及配套试剂(北京，泰诺德公司);LBY-BX红细胞变形仪(北京，普利生仪器有限公司);550型酶标仪(美国，Bio-Rad公司)，Arg(美国，Fluka公司)、血浆游离血红蛋白测定试剂盒(北京，瑞尔达生物科技有限公司)等。

1.2.2 血液标本:血液由廊坊市中心血站提供。选择4名廊坊市定期无偿献血者，2人为O型，1人为A型，1人为B型，RhD血型均为阳性，均为汉族，年龄30～46岁。抽取静脉血400 ml/人，分装为200 ml/袋，其中一袋用白细胞滤器去除白细胞，分离出红细胞，加入红细胞保养液，制备成悬浮红细胞，放置在4℃血液储存冰箱中。标本留取在严格的无菌条件下进行，按照各检测项目要求，每7天留取1次，进行检测。全部血液和血液制品4℃保存。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组:动物随机分为实验组(L-Arg组)和对照组，每组10只。实验组在CPD-A保养液中加入L-Arg，终浓度为3 000 μmol/L;对照组:用等体积的盐水代替L-Arg。

1.3.2 实验过程:用断头法处死大鼠，取其主动脉血管并剪成3～5 mm长的小段，利用带挂钩的转换器将血管穿在小三角环上，两三角环穿挂血管的两条底边应平行，使力的方向与换能器金属弹片保持垂直并前负荷归零。当血管环预收缩至平台时，加入不含精氨酸的血液，等待15 min左右，等其效用达平台，记录曲线，采集信号;放掉血液，重新用K-H液平衡45 min，每15分钟换1次液。待张力恢复到0时，重复第7步，用KCl重新建立收缩平台;加入含精氨酸的血液，待15分钟后，等其效用达平台，记录曲线，采集信号。

1.4 红细胞理化特性相关指标的检测 电解质、血气分析、RBC变形性、聚集性、总 Hb-NO。

1.5 统计学分析 应用SAS 9.1统计软件，先用VC、CS、UN、AR1和SPPOW 5种协方差结构模型拟合资料的情况，选择AIC、BIC最小的模型，说明该模型拟合资料较好;主动脉环实验采用具有1个重复测量的两因素设计定量资料的方差分析，其他数据采用具有两个重复测量的两因素设计定量资料的方差分析，计算F值和P值，再进行各组受试对象在不同时间点之间的两两比较，计算出P值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组血液pH值、离子浓度、ME及碳酸氢盐浓度检测 L-Arg 组与对照组分别在 0、7、14、21、28、35 d时检测血液中pH值、离子浓度、ME和碳酸氢盐浓度，经方差分析和各时间点两两比较，以上各指标2组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 2组不同时间点血液中pH值、离子浓度、ME及碳酸氢盐浓度比较n=10，±s

表1 2组不同时间点血液中pH值、离子浓度、ME及碳酸氢盐浓度比较n=10，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d pH项目值对照组 6.79 ±0.09 6.58 ±0.03 6.52 ±0.04 6.49 ±0.04 6.42 ±0.02 6.43 ±0.03 L-Arg 组 6.78 ±0.07 6.59 ±0.04 6.52 ±0.05 6.49 ±0.05 6.43 ±0.03 6.43 ±0.02 K+(mmol/L)对照组 2.55 ±0.19 7.59 ±0.22 11.18 ±0.36 14.25 ±0.37 17.53 ±0.73 19.63 ±1.02 L-Arg 组 2.53 ±0.10 7.58 ±0.22 11.23 ±0.32 14.22 ±0.35 17.58 ±0.68 18.68 ±0.99 Na+(mmol/L)对照组 128.8 ±2.8 121.2 ±1.0 117.8 ±0.5 113.8 ±0.5 110.8 ±1.5 109.8 ±1.5 L-Arg 组 128.0 ±1.4 121.25 ±0.95 117.0 ±0.5 113.7 ±0.5 111.0 ±1.4 109.7 ±1.5 Cl－(mmol/L)对照组 68.0 ±4.8 63.9 ±2.1 64.0 ±1.4 64.5 ±2.1 68.8 ±1.3 65.8 ±1.3 L-Arg 组 68.0 ±4.8 63.8 ±1.0 64.2 ±1.2 65.0 ±1.8 68.8 ±0.5 66.5 ±0.6 ME离子(mmol/L)对照组 1.4 ±0.4 5.2 ±0.9 7.8 ±1.1 10.4 ±1.3 10.4 ±1.3 13.5 ±0.8 L-Arg 组 1.3 ±0.4 5.2 ±0.8 7.9 ±1.3 10.6 ±1.4 11.1 ±2.0 13.6 ±0.8碳酸氢盐离子(mmol/L)对照组 8.33 ±1.57 4.78 ±0.59 3.78 ±0.55 3.23 ±0.50 2.60 ±0.22 2.58 ±0.24 L-Arg 组 8.10 ±1.12 4.78 ±0.62 3.83 ±0.64 3.28 ±0.55 2.55 ±0.26 2.58 ±0.24

2.2 2 组血气分析结果 分别与保存 0、7、14、21、28、35 d取血，进行血气分析，L-Arg对库存血氧分压(PO2)、二氧化碳分压(PCO2)和血氧饱和度(SO2)无明显影响(P ＞0.05)。L-Arg组 PO2、PCO2和 SO2的检测结果与对照组分别在各个时间点进行两两比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图2。

表2 2组不同时间血气分析比较n=10，x¯±s

2.3 2组红细胞变形性和聚集性检测 分别与0、7、14、21、28、35 d取血，检测红细胞的变形性和聚集性，L-Arg对红细胞变形性和聚集性的影响差异无统计学意义(P ＞0.05)。2组红细胞变形性(图3-A)和聚集性(图3-B)分别在各时间点，进行两两比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表3、图1。

表3 2组红细胞变形性和聚集性比较n=10，x¯±s

图1 2组红细胞变型性和聚集性比较

2.4 2组游离血红蛋白检测 分别于0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d取血，检测游离血红蛋白含量(图4)。在0 d、7 d、14 d时，方差分析和两两比较结果显示，2组游离血红蛋白含量差异无统计学意义(P＞0.05)。在21 d、28 d、35 d时，L-Arg组游离血红蛋白含量低于对照组，方差分析和各时间点两两比较结果差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表4、图2。

2.5 2组血管舒张功能检测 L-Arg组与对照组分别在7 d、16 d、35 d时，用大鼠主动脉环实验检测血管舒张功能。方差分析结果显示，L-Arg对血管舒张功能的影响具有统计学意义(P＜0.01)。L-Arg组血管舒张功能与对照组在各时间点进行两两比较，结果差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表5、图3。

表4 2组不同时间点血液中游离血红蛋白含量 n=10，mg/L，±s

表4 2组不同时间点血液中游离血红蛋白含量 n=10，mg/L，±s

0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d对照组 25±17 79±31 201±52 284±91 486±103 596±112组别L-Arg组 26±17 76±14 157±36 200±43* 364±72* 455±66*

图2 2组游离血红蛋白水平比较

表5 2组不同时间点血管舒张能力 n=10，%，±s

表5 2组不同时间点血管舒张能力 n=10，%，±s

注:与对照组比较，*P ＜0.05

7 d 16 d 35 d对照组 44±3 37±12 24±6组别L-Arg组 76±5* 64±25* 55±12*

3 讨论

图3 2组不同时间点血管舒张功能

3.1 L-Arg促进库存血NO生成L-Arg本身是NOS的底物，是产生NO的生成前体，在NOS作用下生成NO和胍氨酸［1］。且L-Arg作为一种治疗血氨升高的氨基酸类药物在临床应用已经比较普遍，不良反应较少。L-Arg做为底物，生成NO后发挥生理功能的相关研究多集中在心血管等领域，在输血领域研究还未见报道。有研究表明，一定剂量的L-Arg能抑制血小板聚集和黏附，降低血黏度，减少栓塞的发生;应用多普勒超声波检查颈动脉血管内膜去除患者脑部的栓塞信号，发现静脉注射L-Arg的患者信号强度明显减小，提示LArg对栓塞性疾病具有一定疗效［2］;L-Arg还有类似硝酸脂类药的作用，对于离体的血管具有舒张作用，特别是对冠状动脉血管的作用更为明显。为了改善库存血舒张血管的功能，避免外源性加入带来的潜在不利影响，本研究利用红细胞上含有功能性eNOS的特点，在血液中加入不同剂量的L-Arg，使其产生内源性的NO，对血管进行调节作用。

3.2 NO对血管功能的调节作用NO是存在于各种细胞内的一种重要的信号分子，可以调节红细胞、白细胞和血小板的功能。SNO是NO的运输形式，从而增加组织灌流，这对红细胞运输氧的功能是十分重要的［3］。红细胞中的血红蛋白已经被公认为是NO的贮存库，传递O2和释放出NO给低pH值或低氧张力区域，引起血管扩张。

国外研究报道在库存血中造成红细胞变形性下降的原因与NO含量的下降有关，NO可以影响RBC膜的性质，质膜将变得僵硬，红细胞脆性增加和变形能力降低而不能轻松通过微血管，从而不利于红细胞对组织供氧［4－6］。研究显示血浆中的NO含量在贮存时间相对稳定，没有发生明显变化，但当红细胞Hb中的SNO酶将NO转换为生物活性的SNO-Hb［7］，才具有血管舒张的活性。当输注库存红细胞时，由于SNO-Hb已经耗竭，血液扩张血管功能失调，加之红细胞变形能力减弱，则血液会堆积在较大的血管，进一步引起堵塞和缺血，在缺血患者中引起不良后果。

3.3 L-Arg可以通过促进库存血NO生成调节血管舒张功能。本实验中，我们对加入L-Arg的库存血质量进行了初步评价，在保存期内，血液的pH值、离子浓度、ME、碳酸氢盐、血气含量、红细胞的变形性和聚集性均没有发生明显变化;在血液游离血红蛋白检测结果表明，血液保存2周后，实验组与对照组游离血红蛋白含量均有所升高，但是实验组明显低于对照组，推测L-Arg对红细胞膜具有一定的稳定作用。本实验并主要研究了L-Arg对血管功能的影响，结果显示，对照组在血液保存期内，血管舒展功能较弱，1周后均在47%以下，加入L-Arg后，血管舒展功能明显升高，均在55%以上，提示L-Arg对改善库存血的舒张血管功能有明显作用。

L-Arg是人体所需要的营养物质之一，是多种蛋白质的组成成分，如果摄入合理的剂量，不良反应会比较小，甚至没有不良反应发生。在血液中加入L-Arg后，总Hb-NO含量增加，在体外实验中，舒血管功能明显增强，对于急性输血患者，可降低其血管内壁损伤可能，从而减少炎性介质等产生几率。另一方面，以LArg作为底物生成NO后对血管功能进行调节，可以避免因直接加入NO导致库存血重新亚硝基化，难以做到标准化，以及过量的NO导致抑制组织细胞的氧化呼吸，引起多器官功能衰竭的弊端，但对于低血压患者急救用血是否会有不利影响，尚有待进一步研究。尽管L-Arg不是目前获批的红细胞保存液的成分，若在保存液中添加新的成分需要进一步深入的研究，但利用红细胞自身的eNOS，通过加入L-Arg来生增加库存血中的NO含量，是改善血液舒张血管功能的比较理想的方法，是提高输血安全性和有效性的一个可能的发展方向，值得今后进一步深入研究探讨。

1 Sessa WC，Hecker M，Mitchell JA，et al.The metabolism of L-arginine and its significance for the biosynthesis of endothelium-derived relaxing factor:L-glutamine inhibits the generation of L-arginine by cultured endothelial cells.Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87:8607-8611.

2 Kaposzta Z，Baskerville PA，Madge D，et al.L-arginine and S-nitrosoglutathione reduce embolization in humans.Circulation，2001，103:2371-2375.

3 Tsuda K，Kimura K，Nishio I，et al.Nitric oxide improves membrane fluidity of erythrocytes in essential hypertension:an electron paramagnetic resonance investigation.Biochem Biophys Res Commun，2000，275:946-954.

4 Starzyk D，Korbut R，Gryglewski RJ.Effects of nitric oxide and prostacyclin on deformability and aggregability of red blood cells of rats ex vivo and in vitro.J Physiol Pharmacol，1999，50:629-637.

5 Bor-Kucukatay M，Wenby RB，Meiselman HJ，et al.Effects of nitric oxide on red blood cell deformability.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284:H1577-H1584.

6 Mark T，James H，Alan N.Role of circulating nitrite and S-nitrosohemoglobin in the regulation of regional blood flow in humans.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97:11482-11487.

7 Angelo M，Singel DJ，Stamler JS.An S-nitrosothiol(SNO)synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:8366-8371.