蛋白激酶CK2α与食管癌发生发展及临床病理因素的相关性研究

罗鸣 明帮春 骆志国 明星

食管癌在我国的发病率一直居高不下，其中常见类型为鳞癌。食管癌患者早期无明显不适，不易引起重视，多数患者在出现进行性吞咽困难时才到医院就诊，此时疾病多已进展到中晚期，癌症多发生远处转移。食管癌的发生、进展与多种基因表达异常有关，如CD47、miR-21、HER2等基因的高表达和 miR-133a、PTEN等基因的低表达，但这些基因仍不能完全阐释食管癌的复杂［1］。因此，分子标志物的探讨一直是临床诊断食管癌的重点。研究已证实，蛋白激酶CK2α在多种癌症中表达量高，在癌症发展过程中发挥重要作用［2］。本文研究蛋白激酶CK2α对食管癌诊断的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究选取本院收治的120例食管癌患者作为研究对象，其中男65例，女55例;年龄41～77岁，平均年龄(58±11)岁;临床T分期:T1期0例、T2期5例、T3期26例、T4期89例;未发现淋巴结转移102例、转移18例;TNM分期:Ⅰ期11例、Ⅱ期51例、Ⅲ期58例。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:所有患者均经胃镜活检、病理证实为食管鳞癌;既往无肿瘤疾病史;初治患者;患者均按照UICC分期(1997)进行临床分期，分期中M1a是指胸上段食管癌颈淋巴结转移，胸下段食管癌腹腔淋巴结转移。

1.2.2 排除标准:既往其他肿瘤病史者，近期使用化疗或放疗等抗肿瘤治疗方式的患者，未进行病例确诊的患者。

1.3 仪器与试剂 陕西超英生物有限公司提供的组织芯片，编号为ESI202。该组织芯片可采集120点，包括食管癌和距肿瘤1.5 cm以内的癌周组织。英国Abcam公司生产的CK2α单克隆抗体。美国Invitrogen公司生产的PCR试剂盒。江苏碧云天公司提供组织蛋白抽提试剂盒;武汉谷歌公司提供WB制胶试剂盒;武汉博士德公司提供CK2α兔鼠二抗;ECL western印染发光试剂盒购自美国Thermo公司;OligodT与引物购自上海Invitrogen公司。

1.4 标本采集 手术切除肿瘤组织、癌周组织和距离病灶5 cm及以上且没有肿瘤细胞浸润的组织，共9对，送检病理室。

1.5 实验方法 (1)免疫组化检测食管癌组织内CK2α抗体表达:制备石蜡切片，使用二甲苯对组织切片脱蜡，且运用不同浓度乙醇脱水，在96℃下经10%的柠檬酸(碧云天，中国)修复抗原。使用羊血清封闭非特异性抗原。CK2α抗体在4℃中孵育12 h，冲洗后加入酶标兔鼠二抗，室温孵育1 h，染色。(2)Westernblot检测食管癌组织内CK2α表达:切下约20 μg的癌症组织与相对应的正常组织，根据蛋白抽提试剂盒说明书提取组织蛋白。通过BCA试剂盒定量所提取的蛋白，使用酶标仪检测蛋白纯度与浓度，调节每份样品的蛋白浓度，在－80℃下保存蛋白。采用WB制胶试剂盒(谷歌，中国)制作SDS聚丙烯酰胺凝胶，上样缓冲液中加入等量的蛋白，煮沸，变性蛋白。电泳、转膜，再运用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜非特异性抗原位点，加入CK2α抗体4℃过夜，PBST洗膜，ECL试剂显色后，最终使用X线胶片显影，计算机下分析胶片灰度值。实验重复3次。(3)mRNA检测:分离50 μg的食管癌组织与癌周组织，使用Trizol方法提取RNA，紫外分光光度计260/280鉴定样品的浓度与质量，电泳证实总RNA完整性。取5 μg总RNA，根据美国Invitrogen公司PCR试剂盒说明书进行操作，采用PCR法测量mRNA。CK2α基因的引物设计序列如下:正义链序列为:5’-CGAGTTGCTTCCCGATAC-3’，反义链序列为:5’-CTCAGGGCTGACAAGGTG-3’。

1.6 免疫组化结果的评价标准 免疫组织化学法的结果判定标准，按照着色强度进行分级，0分:无色;淡黄色:1分;棕黄色:2分，褐色:3分;显微镜下染色阳性细胞计数:1% ～25%:1分;26% ～50%:2分;51%～75%:3分;＞75%:4分;两个得分项目相加为最终评分，(－)为总分＜3分，阴性表达;(+)为3分，弱阳性表达;(++)为4分，中阳性表达;(+++)为5分，强阳性表达。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以±s表示，2组间计量资料采用2组独立样本t检验，计数资料采用χ2检验、等级资料采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果中食管癌组织与癌旁组织中的CK2α阳性细胞表达情况 食管癌组织中的CK2α中阳性与强阳性表达率分别为35.83%、55.83%均高于癌旁组织的11.67%和0。两种不同组织类型的CK2α表达差异有统计学意义(P＜0.05)。图1A为食管癌组织中CK2α的中阳性表达，图1B为食管癌组织中的 CK2α强阳性表达，图1C为食管癌组织中CK2α的弱阳性表达，图1D为癌旁组织的CK2α阴性表达。见表1、图1。

表1 2组CK2α表达阳性率比较 n=120，例(%)

图1 食管癌组织CK2α着色情况(免疫组化×40)

2.2 CK2α在食管癌组织中的表达与临床分期及淋巴结转移的关系 CK2α阳性表达情况与在不同T分期、淋巴结转移间差异无统计学意义(P ＞0.05)，CK2α阳性表达分布在不同临床TNM分期间差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2。

表2 CK2α在食管癌组织中的表达与临床分期及淋巴结转移的关系例

2.3 CK2α蛋白与CK2αmRNA在食管癌组织与癌旁组织中的表达差异 食管癌组织中的CK2α蛋白、CK2αmRNA表达均高于癌旁组织(P ＜0.05)。见表3、图2。

表3 CK2α蛋白与CK2αmRNA在食管癌组织与癌旁组织中的表达差异n=19，±s

表3 CK2α蛋白与CK2αmRNA在食管癌组织与癌旁组织中的表达差异n=19，±s

组织类型 CK2α蛋白(灰度值) CK2αmRNA(RQ值)5.1 ±1.8 3.2 ±0.8癌旁组织 2.7 ±1.1 1.2 ±0.5 t值食管癌组织5.044 8.856 P值 ＜0.001 ＜0.001

图2 CK2α蛋白与CK2αmRNA在食管癌组织与癌旁组织中的表达差异

3 讨论

我国每年因食管癌的死亡的人群占所有癌症死亡人的1/4。外科手术是食管癌的主要治疗措施，癌细胞浸润组织的范围大小不同，其手术切除范围和术后生存时间的长短差异较大，早期患者5年存活率约70%［3］。食管癌发病初期，癌细胞仅浸润于黏膜或黏膜下层，此时期患者无明显不适或者仅感到胸骨后刺痛、进食哽噎感和反酸嗳气等轻微症状;当患者因进食困难、呼吸困难、声音嘶哑、营养不良和体重下降等症状就诊时，病情已进展到中晚期，该时术后5年生存率为10% ～20%［4］。因此，食管癌的早期诊断具有重要意义。

目前，食管癌的主要诊断方法有CT、MRI等影像技术和病理组织学，其中病理组织学检查结果是食管癌确诊的根本依据。没有特异的食管癌相关肿瘤标志物可早期诊断食管癌。所有真核细胞中均含有蛋白激酶CK2，它具有多种生物功能，主要由2个催化亚基和2个调节亚基构成。CK2α属于该蛋白激酶的催化亚基，是主要的功能基团，主要作用是促使蛋白磷酸化，多种蛋白代谢过程中均有磷酸化底物的参与。

肿瘤的生长过程是癌细胞和宿主之间的相互作用的结果，与蛋白激酶CK2α促使蛋白磷酸化的功能有直接关系［5］。蛋白激酶CK2α可作为一种癌基因，可作为癌症治疗的一个可能靶点，它既可促进细胞有丝分裂、增殖，还具有诱导凋亡作用。机体内多种信号通路的转导都需要蛋白激酶CK2α的参与，且在多种癌组织中高表达，如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌等［6，7］。研究报道，头颈部鳞癌组织中蛋白激酶CK2α的含量和活性明显增多，增加程度与癌症的侵袭性和预后间存在相关性［8］。蛋白激酶CK2α可能通过促使核受体辅阻遏物的磷酸化，阻止其泛素化而发生代谢分解，最终促进癌细胞的侵袭［9］。食管癌组织中的CK2α中阳性与强阳性表达率明显高于癌旁组织，提示蛋白激酶CK2α可能参与食管癌的发病。

喉癌细胞的凋亡过程中CK2α起到关键性作用，有可能作为该癌症治疗的分子靶点，另外，蛋白激酶CK2α与直肠癌的分期、分化和侵袭有关，可作为判断直肠癌预后的一个指标。因此，蛋白激酶CK2α可作为一些癌症的肿瘤标志物和评估患者预后的指标。食管癌患者的预后与其TNM分期有着密切的关系，有研究报道，根据蛋白激酶CK2α的表达量可推测食管癌的进展程度［10］，本研究显示，食管癌组织中的CK2α蛋白表达和CK2αmRNA均显著的高于癌旁组织，提示蛋白激酶CK2α可作为食管癌临床分期的预测指标。

综上所述，蛋白激酶CK2α与食管癌的发生和癌细胞侵袭存在重要的联系，可以作为临床上对食管癌病变程度的一种分子判定标准。本研究的不足之处在于样本量小，说服力不够，后续研究应加大样本，重复进行体内外实验，进一步证实蛋白激酶CK2α可作为食管癌病程进展的预测指标。

1 王立东，宋昕.环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响.郑州大学学报(医学版)，2011，46:1-3.

2 赫捷，邵康.中国食管癌流行病学现状、诊疗现状及未来对策.中国癌症杂志，2011，21:501-503.

3 黄轶轩，周少华，薛洪省，等.蛋白激酶CK2与人类恶性肿瘤.中国肺癌杂志，2012，15:439-441.

4 张薇，张元元，蔡灏，等.蛋白激酶CK2β亚基在肝癌中上调表达及其对肝癌细胞增殖和迁移的影响.复旦学报(自然科学版)，2013，52:247-249.

5 Laramas M，Paramas D，Filhol O，et al.Nuclear localization of protein ki-nase CK2 catalytic subunit(CK2 alpha)is associated with poor prognostic factors in human prostate cancer.Eur J Cancer，2007，43:928-934.

6 刘超，刘洋，赵颂，等.蛋白激酶CK2抑制剂TBB对甲状腺鳞癌细胞株SW579 CK2β和Akt表达的影响.吉林大学学报(医学版)，2012，38:276-280.

7 薛剑，靳安民，吕海，等.CK2抑制剂对骨肉瘤细胞增殖和侵袭力的作用研究.中国现代医学杂志，2013，23:38-40.

8 Ahmad KA，Wang G，Slaton J，et al.Targeting CK2 for cancer therapy.Anticancer Drugs，2005，16:1037-1043.

9 陈勃，董忠谊，曹传辉，等.蛋白激酶CK2β在食管癌中的表达及其临床意义.南方医科大学学报，2012，32:1491-1493.

10 曹传辉，陈勃，梁基韵，等.蛋白激酶CK2α在食管癌中的表达及意义.广东医学，2013，34:1680-1683.