乳腺癌血管生成拟态及其与基质金属蛋白酶-2表达的相关性研究

肖丽 姜达

乳腺癌血管生成拟态及其与基质金属蛋白酶-2表达的相关性研究

肖丽 姜达

目的 探讨乳腺癌中是否存在血管生成拟态(VM)，并通过研究其与基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的相关性，初步探讨VM形成的机制。方法 选取女性乳腺癌的石蜡标本共146例作为试验组，再选取20例女性乳腺的良性病变作为对照组，进行过碘酸雪夫氏反应以及CD34的双重染色，观察VM是否存在，再对VM阳性者和阴性者均进行MMP-2染色，比较二者相互关系。结果 VM的阳性表达与肿瘤大小、病理分级和淋巴结转移有关(P＜0.05)。高分化和中低分化乳腺癌组织中VM的阳性率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。在有淋巴结转移的乳腺癌组织中及无淋巴结转移的乳腺癌组织中VM的阳性率比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。MMP-2在乳腺癌组织中表达阳性率与乳腺良性病变比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。MMP-2在乳腺癌组织中的阳性表达率与病理学分级、淋巴结转移有关。高分化的乳腺癌组织MMP-2阳性率和中低分化乳腺癌组织比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。有淋巴结转移的乳腺癌组织MMP-2阳性率和无淋巴结转移的乳腺癌组织比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。MMP-2在VM阳性组中阳性表达率显著高于阴性组，二者在乳腺癌组织中的表达呈正相关性(r=0.550，P＜0.05)。结论 乳腺癌是中存在VM的，MMP-2表达同VM具有相关性。

血管生成拟态;基质金属蛋白酶-2;乳腺肿瘤

肿瘤生长、转移有赖于新的血管的不断生成。Maniotis等［1］于1999年在研究人眼的葡萄膜黑色素瘤微循环时发现了一种新的、与原来经典的肿瘤血管的生成途径绝对不一样的、不依赖于内皮细胞的全新的肿瘤血管生成的新的模式，其称这种模式为血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)。目前在卵巢癌、炎性乳腺癌、前列腺癌及肝癌等多种组织中均发现VM的存在。MMP-2是基质金属蛋白酶的重要成员，在乳腺癌促使肿瘤生长、扩散［2］。目前关于VM与乳腺浸润性导管癌及MMP-2相关性的研究比较少。本研究拟通过进行CD34和PAS双重染色观察乳腺浸润性导管癌中是否存在着VM，同时进一步探讨MMP-2与乳腺癌中VM及肿瘤转移的关系，从而探讨具有VM的肿瘤是否更加具有侵袭性、转移性及提示更差预后。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂

1.1.1 标本来源:146例乳腺癌标本(试验组)来自河北省沧州中西医结合医院2006至2010年手术切除乳腺癌的存档蜡块。患者术前未经过新辅助化疗，石蜡切片经多位高年资病理医师确诊为乳腺浸润性导管癌。患者均为女性，年龄27～80岁，平均47岁;肿瘤直径1～7.5 cm;腋窝淋巴结阳性90例，阴性56例;根据WHO(1981)乳腺癌分类标准方法进行组织学分级，其中Ⅰ级(高分化)30例，Ⅱ+Ⅲ级(中低分化)116例。另选20例乳腺良性病变(乳腺纤维腺瘤10例、乳腺增生10例)作对照。

1.1.2 主要试剂:MMP-2单克隆抗体、CD34单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒及糖原染色试剂盒均购于福州迈新公司。

1.2 方法

1.2.1 常规免疫组织化学实验步骤:免疫组织化学SP法。蜡块4 μm连续切片，常规脱蜡水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物的活性，柠檬酸缓冲液微波法修复，加入抗体，4℃过夜;DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，0.1%盐酸分化，PBS返蓝;切片经梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封固。已知阳性切片作阳性对照;PBS液代替一抗作空白对照。

1.2.2 CD34与 PAS 双重染色步骤:首先进行 CD34免疫组织化学染色，DAB显色后，显微镜下观察，待血管内皮细胞着色后，水流冲洗1 min终止显色反应。将切片置于0.5%的过碘酸溶液中氧化10 min，水流冲洗10 min后置于Schiff液中，避光环境下PAS液反应15 min，弃去 Schiff液，直接滴加偏重亚硫酸钠溶液2次，1 min/次，蒸馏水冲洗2次，1 min/次。自来水冲洗2 min，蒸馏水返色10 min以上。苏木精浅染细胞核，脱水、透明，中性树胶封片。

1.3 结果判断

1.3.1 VM的判定:管道外周是一层厚薄不均匀的过碘酸雪夫氏(PAS)反应阳性、CD34染色阴性的物质构成的界膜，管腔内壁没有血管内皮细胞的覆盖，周围没有出血坏死和炎性细胞浸润［3］。

1.3.2 MMP-2染色结果判定:在细胞膜或细胞质有棕黄色颗粒沉着者为阳性。阳性细胞数目评分:无阳性细胞为0分，阳性细胞数＜25%为1分，阳性细胞25% ～50%为2分，阳性细胞51% ～75%为3分，阳性细胞＞75%为4分。染色强度分级:无染色为0分，弱染色为1分，中等强度染色为2分，强染色为3分，计算各抗体的染色的强度和阳性细胞数之和，以3～7分为阳性。

1.4 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，计数资料比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman相关统计法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌与VM

2.1.1 乳腺浸润性导管癌中存在VM:HE染色下可见由肿瘤细胞围成的类似管道样的结构，内可见红细胞，管道内壁无内皮细胞，管腔内未见坏死崩解的炎性细胞及肿瘤细胞，不同于肿瘤中心区域常见的坏死灶。PAS、CD34双重染色后可见由PAS阳性物质围成的基底膜样结构将肿瘤细胞和红细胞分开。围成管腔的细胞因CD34染色均阴性，结合细胞异型性，证实其不是内皮细胞，而是癌细胞。本研究中146例乳腺癌组织中有38例存在VM，其表达率为26.0%(38/146)，对照组的乳腺良性组织中未发现VM。见图1～8。

2.1.2 VM与乳腺癌临床病理特征的关系:VM的阳性表达与患者年龄无关(P＞0.05)，而与肿瘤大小、病理分级和淋巴结转移有关(P＜0.05)。高分化和中低分化乳腺癌组织中VM的阳性率分别为0(0/30)和32.8%(38/116)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。在有淋巴结转移的乳腺癌组织中及无淋巴结转移的乳腺癌组织中VM的阳性率分别为40%(36/90)和3.6%(2/56)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。同时发现VM的阳性率与临床分期有关系，分期越晚，阳性率越高，但因样本量有限，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图1 试验组乳腺癌组织中的VM(如箭头所示)(HE×100)

图2 试验组乳腺癌组织中的VM(如箭头所示)(HE×400)

图3 试验组乳腺癌组织中的VM(如箭头所示)(PAS+CD34×100)

图4 试验组乳腺癌组织中的VM(如箭头所示)(PAS+CD34×400)

图5 对照组对照组中无VM(HE×100)

图6 对照组中无VM(HE×400)

图7 对照组中无 VM(PAS+CD34×100)

图8 对照组中无VM(PAS+CD34×400)

表1 VM和病理参数 例

2.2 MMP-2在乳腺癌中的表达

2.2.1 MMP-2在乳腺癌和乳腺良性病变组织中的表达比较:MMP-2在乳腺癌组织中表达阳性率为71.9%(105/146)，在乳腺良性病变(乳腺纤维腺瘤，乳腺增生)中的表达阳性率为20%(4/20)，差异有统计学意义(P＜0.05)。研究中还发现MMP-2在乳腺癌组织中表达强度较乳腺良性组织中明显增强，但因样本量小，统计学无意义。见表2，图9～12。

表2 2组MMP-2的表达 例

图9 试验组MMP-2在VM阳性的乳腺癌组织中的表达(绿色箭头标注VM，红色箭头标注MMP-2阳性细胞)(HE×100)

图10 试验组MMP-2在VM阳性的乳腺癌组织中的表达(绿色箭头标注VM，红色箭头标注MMP-2阳性细胞)(HE×400)

图11 对照组MMP-2在对照组组织中的表达(如箭头所示)(HE×100)

图12 对照组MMP-2在对照组组织中的表达(如箭头所示)(HE×400)

2.2.2 MMP-2与乳腺癌临床病理特征的关系:MMP-2在乳腺癌组织中的阳性表达率与患者年龄以及肿瘤大小均无关(P＞0.05)，与病理学分级、淋巴结转移有关。在高分化的乳腺癌组织和中低分化乳腺癌组织中，MMP-2 阳性率分别为 53.3%(16/30)和 76.7%(89/116)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。在有淋巴结转移的乳腺癌组织和无淋巴结转移的乳腺癌组织中，MMP-2 阳性率分别为 82.2%(74/90)和 55.4%(31/56)，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表3。

2.3 VM与MMP-2 38例乳腺癌VM阳性组织中有38例MMP-2阳性表达，阳性率为100%(38/38)，即全部阳性表达，在108例乳腺癌VM阴性的组织中有67例MMP-2阳性表达，其阳性率为62.0%(68/108)。MMP-2在VM阳性组中阳性表达率显著高于阴性组，二者在乳腺癌组织中的表达有显著相关性(r=0.550，P ＜0.05)。见表 4。

表3 MMP-2和病理参数 例

表4 VM和MMP-2相关性 例

3 讨论

3.1 乳腺癌与VM 侵袭和转移是恶性肿瘤显著的、独特的生物学特性，此两种特性需依赖于血液的供应、细胞移动分子、一些细胞黏附分子和各种降解酶的参与。Maniotis等［1］发现了一种全新的肿瘤血管生成模式—VM。VM指某些恶性细胞发生基因逆转，回到多潜能未分化的胚胎样细胞表型，模拟内皮细胞，自身变形，与细胞外基质互相作用，模仿血管壁的结构，形成可运输血液的管道系统，重新塑造肿瘤微循环，并相连于宿主血管，使肿瘤获得相应的血液供应。此特性在一定程度上说明了存在VM的肿瘤更具有转移能力及侵袭性，临床上的表现就是患者预后较差［4］。近几年的研究表明，VM存在于多种肿瘤组织中，如肺癌、肝癌［5］、卵巢癌［6］、消化道肿瘤［7］、炎性乳癌［8］、睾丸生殖细胞恶性肿瘤［9］等。本研究结果显示，146例乳腺癌组织经CD34与PAS双重染色，其中38例的标本中可见VM。该结果与Shirakawa等［9］在炎性乳癌中的研究结果相一致。近几年关于VM与肿瘤临床分期相关性的研究也很多。承泽农等［10］在对非小细胞肺癌VM的研究中发现具有VM的肿瘤具有低分化、临床分期晚以及更易发生淋巴结转移的特征。本研究也发现类似特点，但因样本量小，差异无统计学意义(P ＞0.05)。

3.2 MMP-2与乳腺癌 恶性肿瘤的浸润、转移是众多因子互相协调、共同作用的结果［11］。这一过程中，基底膜破坏和细胞外基质的降解是一个重要的、并且是始终贯穿的因素。MMPs就是这一过程中不可缺少的酶类。MMP-2是MMPs家族中主要成员之一，分子量72 kD，由肿瘤细胞、间质细胞以酶原形式分泌。杜日昌等［12］研究发现在食管癌的发生、浸润、转移的过程，有MMP-2存在，且其促进食管癌的侵袭、转移。Jones等［13］发现 MMP-2在正常的乳腺组织和乳腺良性肿瘤中无表达或低表达，而在乳腺癌组织中，它的表达和活性均显著增强。已知的MMP-2在乳腺癌浸润和转移的机制包括［14］:降解细胞外基质、调节细胞间的黏附、促进新生血管形成。在本研究中，MMP-2在乳腺癌中的阳性表达率为71.9%，显著高于乳腺良性病变中20%的阳性表达率，差异有统计学意义(P＜0.05)。MMP-2的过表达与乳腺癌组织学分级有关，病理学分级越低，肿瘤细胞的胞浆、细胞膜染色就越深，MMP-2的阳性表达率也就越高(P ＜0.05)，在有淋巴结转移乳腺癌组织中的阳性表达率显著增高，明显高于无淋巴结转移组织的阳性表达率(P＜0.05)，与患者年龄无关。上述研究结果与其他研究者在胃癌、直肠癌、胰腺癌的研究中的表达相似［15，16］。目前有很多人在研究MMP-2与临床分期的相关性。夏庆安等［17］在对乳腺癌组织中 MMP-2的研究中发现MMP-2高表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和预后复发相关。本研究也发现类似的相关性，但样本量小，差异无统计学意义(P＞0.05)。由此可说明乳腺恶性肿瘤细胞在发生浸润、转移的过程中，MMP-2的表达及其活性起着十分重要的作用。检测MMP-2，可有效评估乳腺癌的预后，并早期采取治疗措施。对于那些分化程度低、恶性程度较高、转移发生早的乳腺癌，可通过控制MMP-2机制，达到控制乳腺癌细胞的浸润、转移的目的。

3.3 MMP-2 与 VM Hess等［18］在对恶性黑色素瘤VM的研究中发现，MMP-2是VM的重要载体。在本研究中，在38例存在VM的乳腺癌组织中，MMP-2全部阳性表达，在108例VM阴性的乳腺癌组织中有67例MMP-2阳性表达，有VM组的MMP-2阳性表达率显著高于无VM组的阳性表达率。二者在乳腺癌组织中的表达呈正相关(r=0.550，P ＜0.05)，说明在乳腺癌浸润转移的VM机制中MMP-2同样起着非常重要的作用，或者说两者之间存在密切关联。

本研究小组目前仍在继续该领域的研究，采用RT-PCR、Western blot等方法检测乳腺癌组织中VM表达情况、MMP-2表达情况，及其与临床分期等临床病理特征的关系。

有研究表明，抗肿瘤血管生成抑制剂对VM的作用不明显，故设计抗肿瘤血管生成的方法时，应该考虑其对VM的作用，可通过抵抗MMP-2等黏附分子表达，来干扰肿瘤细胞重塑等机制，达到抑制VM生成，阻断肿瘤血液供应的目的，为治疗高度恶性肿瘤提供更多的思路与机会。

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Correlation between vascularization mimesis and expression of matrix metalloproteinase-2 in breast cancer

XIAO Li*，JIANG Da.*Department of Oncology，Integrated Traditional Chinese Medicine-Western Medicine Hospital，Hebei，Cangzhou 061001，China

ObjectiveTo investigate whether there exists vascularization mimesis(VM)in breast cancer，and to research the correlation between vascularization mimesis and expression of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in order to explore formative mechanism of VM.MethodsOne hundred and forty-six paraffin-embedded specimens of breast cancer were selected as trial group，and 20 benign breast lesion specimens were served as control group，All the specimens were stained by PAS and CD34，then VM was observed，moreover，these specimens were stained by MMP-2，and the correlation between positive VM and negative VM was analyzed.ResultsThe positive expression of VM was correlated to tumor size，pathological grading，lymph node metastasis.There were significant differences in the positive expression rates of VM between well differentiated tissues of breast cancer and medium differentiated，poor differentiated tissues of breast cancer(P ＜ 0.05).There was a significant difference in the positive rate of VM between breast cancer tissue with lymph node metastasis and breast cancer tissue without lymph node metastasis(P ＜0.05).There was a significant difference in the positive expression rate of MMP-2 between breast cancer tissue and breast benign lesion(P ＜ 0.05).There were significant differences in the positiveexpression rates of MMP-2 among different pathological grades as well as with or without lymph node metastasis(P＜0.05).There was a significant difference in the positive expression rate of MMP-2 between well differentiated tissues of breast cancer and medium differentiated，poor differentiated tissues of breast cancer(P ＜0.05).The positice expression rates of MMP-2 in positive VM group were significantly higher than those in negative VM group.ConclusionVM exists in breast cancer，moreover，the expression of MMP-2 is positively correlated to VM.

vascularization mimesis;matrix metalloproteinases;breast neoplasms

R 737.9

A

1002－7386(2015)14－2085－05

10.3969/j.issn.1002 －7386.2015.14.001

061001 河北省沧州中西医结合医院肿瘤内科(肖丽);河北医科大学第四医院东院区肿瘤内科(姜达)

姜达，050035 石家庄市，河北医科大学第四医院东院区肿瘤内科;E-mail:jiangda139@163.com

2015－01－19)