骨肉瘤常用化疗药物作用的分子机制及用药方法选择

徐袁秋 刘思源 张卫华 刘星 林亮 许新明

骨肉瘤是最常见的原发于骨组织的恶性肿瘤，好发于青少年，易发生早期肺转移，预后较差，是严重危害青少年健康的恶性肿瘤之一。对化疗有一定的敏感性。目前对骨肉瘤患者多采用以吡柔比星、顺铂、甲氨蝶呤和异环磷酰胺等综合化疗方法。关于具体的用药方法和作用机制并未作深入的研究。本实验旨在对吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺等药物对骨肉瘤细胞株(MG-63)的细胞毒性及分子作用机制，为临床应用提供实验依据的同时指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 材料 人成骨肉瘤细胞株(MG-63)取自河北医科大学第三医院综合实验中心;吡柔比星为深圳万乐药业有限公司产品;顺铂(批号:8090162DB)、卡铂(批号:8110172ES)为齐鲁制药有限公司产品;甲氨喋呤(批号:08082511)、异环磷酰胺(批号:08062811)为江苏恒瑞医药有限公司产品;无支原体胎牛血清为杭州四季青生物制品厂产品;使用的其他材料包括 MTT、DMEM培养基、二甲基亚砜、EDTA、胰蛋白酶、细胞培养瓶、48孔培养板、0.22 μm微孔虑膜及加样器。

1.2 方法

1.2.1 在 37℃、5%CO2、95% 空气、饱和湿度下 CO2孵箱内闭式传代培养细胞，将传代后第3天处于指数增殖期细胞经EDTA和胰酶消化制成悬液后分别接种到3个48孔板上，每孔加90 μl的细胞悬液(细胞浓度为1.5×104/ml)和10 μl的药物。加入不同浓度的药物，培养的时间分别为24、48、72 h。利用倒置显微镜观察细胞的形态。

1.2.2 经上述处理，分别在 24、48、72 h 后加 MTT 10 μl/孔，继续培养4 h，在平板离心机上离心10 min，2 000 r/min，弃上清液，加二甲亚砜 150 μl/孔，待结晶溶解后，用全自动酶标仪(波长690 nm)测定每一孔的吸光度 A值(OD值)，并计算其细胞毒性指数值(CI)，CI=(对照组A值－试验组A值)/对照组A值×100%。利用MTT法制作药物浓度时间曲线。

1.2.3 利用流式细胞仪进行细胞周期的分析。将浓度为0.4×106/ml的细胞悬液12 ml和不同浓度的吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤、异环磷酰胺共同置于75 cm2的培养瓶分别培养24、48和72 h后将培养液连同用EDTA和胰蛋白酶消化下的骨肉瘤细胞一起离心、清洗，经染色后行细胞周期分析，了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。

1.2.4 利用免疫印迹法检测不同基因的变化情况。将浓度为0.4×106/ml的细胞悬液12 ml和不同浓度的吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤共同置于75 cm2的培养瓶培养48 h，收集细胞离心，于－20℃保存。配置凝胶后加样电泳，并转膜，分别加入一抗和二抗并进行图像分析

1.3 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，各组数据比较采用多因变量方差分析，两两比较采用t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞在倒置显微镜下的形态学变化 倒置显微镜下观察到骨肉瘤细胞(MG-63)与吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤培养基作用24 h后细胞增值数量减少，少量细胞坏死漂浮，48 h后漂浮细胞明显增多，一部分胞膜破裂细胞坏死，存活细胞颜色晦暗，胞浆内颗粒增多增粗，72 h后部分细胞漂浮，大部分细胞溶解。见图1。

图1 不同种类的化疗药不同时间对MG-63的抑制情况(HE×20)

2.2 MTT实验 不同浓度吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤对MG-63细胞分别作用24、48和72 h后，对细胞的生长均起到抑制作用。不同时间组及不同浓度组与对照组相比，顺铂和卡铂对MG-63细胞的生长抑制作用差异均有统计学意义(P＜0.05)，且随着药物浓度的增加及作用时间的延长抑制率也随之增加，呈剂量-时间效应关系。根据生长曲线显示对骨肉瘤细胞株卡铂的浓度约需25倍于顺铂才能产生相似的生长抑制效应。见图2。

图2 不同种类的化疗药不同时间对MG-63的抑制生长曲线

2.3 细胞周期分析显示 不同浓度吡柔比星、顺铂、卡铂作用骨肉瘤细胞24、48和72 h后收集细胞流式细胞仪分析结果显示与对照组相比，在细胞各期均有不同的凋亡峰，细胞周期各期所占比例无明显变化，抑制作用呈剂量依赖性。见图3。

2.4 免疫印迹结果显示 PCNA在与吡柔比星、顺铂、卡铂、甲氨蝶呤作用的骨肉瘤细胞株表达与对照组相比较明显下降，Bax表达较对照组明显增加，Bcl-2表达略减少。cyclin D1、cyclin E的表达明显减少。见图4。

3 讨论

图3 不同种类的化疗药不同时间对MG-63细胞株的抑制的流式分析

图4 不同种类的化疗药不同时间对MG-63细胞株的蛋白免疫沉淀分析

骨肉瘤是儿童和青少年常见的骨恶性肿瘤，尽管早期手术和辅助化疗使得患者预后有明显的改善，但目前仍有28.4%的患者死于远处转移［1］。对于远处转移的患者，化疗是惟一有效的治疗方法，新辅助化疗对提高骨肉瘤患者的5年生存率至关重要，但应用历史相对其他恶性肿瘤较短，化疗药物种类不多，探索合理化疗方案成为当前关键性问题。吡柔比星是阿霉素的衍生物，治疗骨肉瘤作用强于阿霉素，而心脏毒性明显小于阿霉素，因而近年来被广泛应用于临床，但它对骨肉瘤细胞影响的机制目前尚无定论。本实验MTT和FMC结果显示随时间延长不同浓度吡柔比星对细胞的最终抑制作用是一致的。凋亡峰最高时的浓度可能是最适浓度，凋亡峰最高的时间和浓度效果最佳。

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)合成并存在于细胞核内，是一种细胞周期调节蛋白，常作为测定细胞增殖水平的指标，其在细胞核内阳性表达的高低与细胞增殖活性密切相关。测定化疗前后肿瘤细胞PCNA的表达，可以对化疗效果作出评价。Nakashima等［2］用免疫组化的方法检测26例骨肉瘤标本，结果示PCNA的阳性率为80.8%，并指出PCNA能较好地反映骨肉瘤组织的增殖能力，通过检测PCNA在化疗前后骨肉瘤组织中的变化，能预测术前化疗的疗效。本实验中经吡柔比星、顺铂、卡铂和甲氨蝶呤作用后PCNA蛋白表达均受抑制，表明可通过抑制PCNA表达使细胞增殖受限。另外，不同浓度吡柔比星、顺铂、卡铂和甲氨蝶呤作用骨肉瘤细胞后细胞G0/G1比例呈先下降后上升趋势，表明对骨肉瘤细胞增殖周期G0/G1期延缓作用。蛋白印记法发现吡柔比星、顺铂、卡铂和甲氨蝶呤分别作用48 h后与对照组相比较cyclin D1和cyclin E过表达均受抑制。通过对细胞周期的影响达到抑制肿瘤生长的作用。

抗肿瘤药物对肿瘤细胞的抑制方式有多种，如诱导细胞分化、凋亡，促进细胞坏死等。近几年肿瘤生物治疗的热点是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗目的，此种疗法称为肿瘤的凋亡疗法［3］，细胞凋亡受许多基因调控，Bcl-2基因是与细胞凋亡关系最为密切的凋亡抑制基因。Bax表达本身并不阻断凋亡，而是具有对抗Bcl-2蛋白抑制凋亡的作用。本实验通过蛋白印记法结果显示吡柔比星、顺铂、卡铂和甲氨蝶呤分别作用48 h后与对照组相比较Bcl-2表达率降低，Bax表达率升高。

本试验中PCNA在顺铂组和卡铂组骨肉瘤表达与对照组相比较明显下降，表明顺铂和卡铂对骨肉瘤细胞株抑制增殖作用明显［4］。而Bax表达较对照组明显增加，Bcl-2表达略减少，结合倒置显微镜下的细胞形态学观察，说明顺铂、卡铂与骨肉瘤细胞作用后存在凋亡现象，但是未能形成凋亡峰，这可能与铂类化合物能够作用细胞生长各个周期有关［5，6］。通过分析顺铂、卡铂对骨肉瘤细胞各个生长周期的影响及蛋白分子表达情况，肯定了卡铂和顺铂对骨肉瘤细胞株相似作用机制和细胞毒性反应，了解了其具体作用机制，为临床应用提供了实验依据。

MTX是最早公认的对骨肉瘤化疗有效的药物，对多种肿瘤具有良好的抗肿瘤活性，其作用机制为通过对二氢叶酸还原酶(DNA合成所需的重要酶)竞争性抑制而抑制细胞DNA的合成发挥作用，是骨与软组织肿瘤化疗的首选药物［7］，单药有效率通常在20% ～30%，提高剂量可以克服肿瘤的耐药性，增加组织坏死反应率，但大剂量MTX治疗可产生严重的甚至致命的毒性反应，如肝功能损害、肾功能衰竭、骨髓抑制、胃肠道反应、皮肤黏膜反应以及因此而引发的继发性感染、出血等。有关化学药物作用的确切机制至今尚未完全清楚。随着生物化学修饰的研究，特别是以此为依据的多制剂联合疗法中，制剂间的修饰作用，用药剂量，投药顺序等方面的研究和应用，使得肿瘤化疗效果明显提高，多种药物联合的意义在于将抑制于不同细胞周期的肿瘤细胞进一步杀灭。未来对骨肉瘤的治疗以及预防肺转移的手段在于多种药物的联合应用，目前，我们正在寻找新的对骨肉瘤有效的药物［8］。

1 Niu XH，Cai YB，Zhang Q，et al.Long-term results of combined therapy for primary osteosarcoma in extremities of 189 cases.Zhonghua Wai Ke Za Zhi，2005，43:1576-1579.

2 Nakashima H，Nishida Y，Sugiura H，et al.Telomerase，p53 and PCNA activity in osteosarcoma.Eur J Surg Oncol，2003，29:564-567.

3 Fulda S，Debatin KM.Targeting apoptosis pathways in cancer therapy.Curr Cancer Drug Targets，2004，4:569-576.

4 Li Y，Bckesj CM，Haldosén LA，et al.Resveratrol inhibits proliferation and promotes apoptosis of osteosarcoma cells.Eur J Pharmacol，2009，609:13-18.

5 Ohe Y，Ohashi Y，Kubota K，et al.Randomized phase III study of cisplatin plus irinotecan versus carboplatin plus paclitaxel，cisplatin plus gemcitabine，and cisplatin plus vinorelbine for advanced non-small-cell lung cancer:Four-Arm Cooperative Study in Japan.Ann Oncol，2007，18:317-323.

6 Martelli L，Di Mario F，Botti P，et al.Accumulation，platinum-DNA adduct formation and cytotoxicity of cisplatin，oxaliplatin and satraplatin in sensitive and resistant human osteosarcoma cell lines，characterized by p53 wild-type status.Biochem Pharmacol，2007，74:20-27.

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8 Liu SY，Song SX，Lin L，et al.Molecular mechanism of cell apoptosis by paclitaxel and pirarubicin in a human osteosarcoma cell line.Chemotherapy，2010，56:101-107.