丹酚酸A对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞氧化损伤保护的实验研究

易志红 白洋 陈立荪 徐峰 陈利江

丹酚酸A对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞氧化损伤保护的实验研究

易志红 白洋 陈立荪 徐峰 陈利江

目的 观察丹酚酸A对H2O2所致大鼠脑微血管内皮细胞（RCMECs）氧化损伤的保护作用，并探讨其可能的作用机制。方法 分离并培养大鼠脑微血管内皮细胞，用H2O2损伤的方法建立氧自由基损伤模型。采用丹酚酸A进行干预后，分别测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、血栓素B2（TXB2）水平、6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）的含量，以及细胞内和培养液中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果 H2O2致RCMECs氧化损伤后，细胞LDH释放水平、TXB2和MDA的含量均明显增加，同时6-keto-PGF1α含量和SOD活性显著下降；而丹酚酸A预处理后能呈浓度依赖性的降低RCMECs氧化损伤后LDH水平、TXB2含量和细胞内外的MDA含量，提高受损细胞6-keto-PGF1α的表达和细胞内外SOD活性。结论 丹酚酸A对H2O2所致RCMECs氧化损伤具有保护作用，其机制可能与其抗氧化作用有关。

丹酚酸A H2O2氧自由基损伤 脑微血管内皮细胞

血管内皮细胞是血液与组织间进行物质交换的屏障，其能分泌和释放多种生物活性物质，参与多种生理和病理过程[1-2]。在脑缺血损伤时，H2O2造成的氧化应激效应可直接导致脑血管内皮细胞的损伤，进而触发渐进性的缺血后低灌注，严重时将导致继发性大脑或脊髓组织退变[3-4]。寻找能对抗缺血性脑血管疾病所致血管内皮细胞氧自由基损伤的药物具有重要的临床意义。丹酚酸A是从丹参中提取的一种水溶性成分，对缺血再灌注引起的心肌细胞损伤具有一定保护作用，其机制可能与其对抗氧化损伤，稳定线粒体膜有关，但目前对于丹酚酸A在脑血管缺血损伤保护中的作用及机制尚不清楚[5-6]。本研究采用大鼠脑微血管内皮细胞（RCMECs）氧化损伤模型，研究了丹酚酸A对RCMECs氧化损伤的保护作用，希望为丹酚酸A用于缺血性脑血管疾病的治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 RCMECs由正大青春宝药业有限公司提供，丹酚酸A（批号：130821）购于上海友思生物技术有限公司；含酚红及不含酚红的M199干粉培养基和Ⅱ型胶原酶购于Gibco公司；新生小牛血清购于杭州四季青生物技术研究所；30%H2O2溶液于临用前稀释配制；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号：20131222）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：20130516）和丙二醛（MDA）试剂盒（批号：20130820）购于南京建成生物工程研究所；6-酮基前列腺素1α（6-keto-PGF1α）测试盒（批号：20140526）及血栓素B2（TXB2）测试盒（批号：20140321）购于天津九鼎医学生物工程有限公司；兔抗人Ⅷ因子相关抗原多克隆抗体（批号：ZA-0321）购于北京中山公司；Edaravone（批号：1138017）购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 H2O2损伤 RCMECs模型的建立和实效分析RCMECs的原代培养、传代及鉴定参照参考文献[7]，并采用MTT比色法确定适宜的H2O2浓度及孵育时间：RCMECs按1×105/孔培养于96孔板中，待其贴壁后分别加入不含酚红的M199培养液配置的H2O2，使其终浓度分别为0.0625、0.125、0.25、0.5和1.0mmol/L的溶液，并分别在37℃、5%CO2培养箱中培养0.5、1、2和4h。采用MTT法，用酶标仪在490nm波长下测定吸光度值，并根据结果选择最适宜的H2O2浓度和孵育时间。其中H2O2浓度测定按Spitz的方法[8]进行。

1.2.2 实验细胞分组 取第2～8代RCMECs按1×105/孔培养于96孔板中，每组6个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待其贴壁后生长至亚融合状态时换成无血清培养基作用12h进行实验。将细胞分为4组：正常组、损伤组、给药组、对照组。其中正常组不加任何处理因素；损伤组根据最适宜的H2O2浓度和孵育时间进行造模；给药组预先给予2.5、5.0、10μmol/L丹酚酸A（分别设为给药组1、给药组2、给药组3），对照组则预先给予0.4μmol/l自由基清除剂edaravone，分别孵育20h后，与损伤组一起根据最适宜H2O2浓度和孵育时间进行造模，并检测下述指标。

1.2.3 RCMECs培养液中LDH活性、TXB2以及6-keto-PGF1α含量的检测 取上述4组细胞培养的上清液各100μl，按照检测试剂盒说明，分别采用比色法检测RCMECs培养液中的LDH活性，采用放射性免疫法检测细胞培养液中血栓素A2的最终代谢产物TXB2的水平和前列环素最终代谢产物6-keto-PGF1α的含量。

1.2.4 RCMECs培养液中SOD活性的检测 采用黄嘌呤氧化酶法分别对各组细胞SOD的吸光度值进行检测并计算其活性。将各组细胞移入离心管中，每管细胞数（1～2）×105个，200×g离心10min，弃上清液；沉淀中加入0.6ml冰三蒸水，旋涡振荡混匀1min；加入0.3 ml无水乙醇，混匀30s；加入三氯甲烷0.3ml，混匀1 min；200×g离心10min；吸取上层抽提液100μl，并按照SOD测定试剂盒说明，比色法检测各组细胞内SOD的吸光度值并计算其活性。

1.2.5 RCMECs培养液和细胞内中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量的检测 MDA含量的检测采用硫代巴比妥酸法。取上清液200μl，按照MDA测定试剂盒说明，以比色法在532 nm处测定吸光度值，并计算培养液中MDA的的含量。细胞内MDA含量的检测方法同细胞内SOD活性测定方法。取抽提液300μl，按照MDA测定试剂盒说明，比色法检测细胞内MDA的吸光度值并计算其含量。以上步骤重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件，计量资料以表示，样本均数间比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析。

2 结果

2.1 H2O2致RCMECs氧化损伤的时效、量效分析 见表1。

表1 H2O2致RCMECs氧化损伤的时效、量效分析

由表1可见，不同浓度H2O2干预者的吸光度值均显著低于0mmol/L者（P＜0.01）；且RCMECs的活性随着H2O2浓度增加及作用时间的延长逐渐降低。由此，实验最终选取了0.125 mmol/L H2O2作用0.5h作为最适的造模条件，这一条件一方面可以缩短实验时间，另一方面能使损伤后细胞活力有效降至正常组50%左右。

2.2 丹酚酸对抗氧化损伤的结果 见表2。

由表2可见，（1）H2O2损伤组细胞LDH释放量较正常组明显增加（P＜0.01）。与损伤组相比，各给药组经丹酚酸A、对照组经edaravone预处理后，均使H2O2所致RCMECs损伤后LDH的释放显著降低（P＜0.05或0.01），并随着丹酚酸A浓度的升高其作用逐渐增强，呈现浓度依赖性；（2）H2O2致RCMECs氧化损伤后，细胞培养液中TXB2的含量显著性增加（P＜0.01）。各给药组丹酚酸A和对照组edaravone预处理后，均使H2O2所致细胞培养液中TXB2的含量明显降低（P＜0.05），并呈现浓度依赖性；同时，H2O2能显著抑制内皮细胞6-keto-PGF1α的表达（P＜0.01），而丹酚酸A预处理则可有效降低H2O2对6-keto-PGF1α表达的抑制作用（P＜0.01），且呈浓度依赖；（3）H2O2可致细胞内和培养液中MDA含量较正常组显著升高（P＜0.01）。而5μmol/L和10μmol/L丹酚酸A给药组，以及对照组则可有效降低MDA含量（P＜0.05）；（4）H2O2能显著抑制RCMECs细胞内和培养液中SOD活性（P＜0.01）。不同给药组丹酚酸A和对照组edaravone预处理后，均可使H2O2作用后细胞内和培养液中SOD的活性明显提高（P＜0.01），并呈现浓度依赖性。

表2 丹酚酸对抗氧化损伤的结果

3 讨论

目前己知氧自由基引发的过氧化反应是缺血性脑损伤的重要机制之一[9-10]。正常情况下，体内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，故不发生自由基连锁反应和组织损伤。脑缺血发作时，脑细胞生物氧化功能发生异常，产生大量自由基，自由基氧化损伤血管内皮细胞、毛细血管基底膜和脑细胞，造成毛细血管通透性增高和细胞功能障碍等[9-10]。本研究中我们采用H2O2作为外源性自由基生成系统，成功建立了大鼠脑微血管内皮细胞（RCMECs）过氧化损伤模型。同时，为进一步分析丹酚酸A在RCMECs氧化损伤中的保护作用和机制，我们重点对氧化损伤过程中几个重要指标进行了评测。

MDA是自由基对内皮细胞损害后，引起生物膜上不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的最终代谢产物，常用来反映组织脂质过氧化损伤的程度[9-10]。而SOD作为目前发现的人体唯一的负氧离子天然酶类清除剂，其活性高低亦可间接反映组织自由基的含量[11-12]。测定MDA和SOD水平不仅可反映内皮损伤的原因而且还可判断内皮损伤的程度。本实验结果显示，H2O2损伤RCMECs后，SOD活性显著降低而MDA含量显著升高，这在一定程度上也表明了该细胞氧化损伤模型的有效性。而丹酚酸A预处理则可增加培养液中及细胞内SOD活性，降低MDA水平。该结果提示丹酚酸A对内皮细胞功能的保护作用可能与其抗过氧化损伤作用有关。

LDH水平的增高是细胞受损的一个敏感指标，它能一定程度上反映细胞的损伤程度。我们的实验发现，H2O2可显著的增加RCMECs中LDH的释放水平，同时，丹酚酸A可呈浓度依赖性的减少H2O2所致RCMECs的LDH过度释放，一定程度上显现了其对氧化损伤的保护作用。

RCMECs不仅是血脑屏障的重要组成部分，还可释放多种生物活性物质如PGI2和TXA2等参与多种生理和病理过程[13]。其中PGI2是花生四烯酸经PGI2合成酶催化合成的一种重要血管活性物质，具有扩张血管、抑制血小板黏附、聚集，以及抑制中性粒细胞产生氧自由基等作用。TXA2是前列腺素H2（PGH2）经TXA2合成酶催化合成的代谢产物，具有收缩脑血管、促进血小板黏附、聚集的作用。PGI2和TXA2互相制衡，维持着正常脑微循环及脑血管内皮功能。而H2O2一方面通过增强环氧酶的活性，刺激RCMECs分泌TXA2，并抑制PGI2合成酶的活性，使PGI2合成减少，从而打破PGI2和TXA2之间的平衡；另一方面，H2O2还可通过Fenton反应生成超氧阴离子氧化损伤内皮细胞，使的PGI2/TXA2失衡，引起血小板聚集及脑微循环障碍，加重脑缺血症状。由于PGI2和TXA2半衰期极短，因此，我们分别测定了其稳定代谢产物6-keto-PGF1α与TXB2，间接反映两者的实际水平。实验结果表明，与正常组相比，H2O2损伤后6-keto-PGF1α含量降低而TXB2含量则升高，两者比值亦显著降低；而丹酚酸A预处理能显著抑制血管内皮细胞氧化损伤后6-keto-PGF1α的降低，并抑制TXB2含量的增高，进一步提示丹酚酸A对H2O2所致过氧化损伤的RCMECs具有保护作用。

综上所述，本实验在成功建立大鼠脑微血管内皮细胞过氧化损伤模型的基础上，发现丹酚酸A对H2O2所致RCMECs损伤具有保护作用，其作用机制可能与丹酚酸A的抗氧化作用有关。

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Protective effects of salvianol acid A on hydrogen peroxide-induced oxidative injury of rat cerebral microvascular endothelial cells

YI Zhihong，BAI Yang，CHEN Lisun，et al.
Department of Internal Medicine-Neurology,Keqiao Traditional Chinese Medicine Hospital, Shaoxing 312030,China

【 Abstract】 Objective To investigate the protective effects of salvianol acid A(Sal A)on hydrogen peroxide-induced oxidative injury in rat cerebral microvascular endothelial cells(RCMECs). Methods RCMECs were isolated and cultured;the cultured cells were treated with hydrogen peroxide to induce the oxidative injury.Different concentrations of SalA were added in cell culture to intervene the cell injury.Lactate dehydrogenase(LDH),malondialdelyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)activities were measured by automatic biochemistry analyzer.Radioimmunoassay was applied to measure the thromboxane B2 (TXB2)and 6-keto-prostaglandin F1α(6-keto-PGF1α). Results After incubated with 0.125 mmol/L hydrogen peroxide for 0.5 h,the viability of RCMECs was significantly inhibited,the LDH,MDA and TXB2 levels in culture supernatant were significantly increased,while 6-keto-PGF1α and SOD levels were decreased.Pre-incubated with different concentrations of SalA for 20h significantly decreased the levels of LDH,MDA and TXB2,and increased 6-keto-PGF1α level and the activity of SOD. Conclusion SalA can protect RCMECs against hydrogen peroxide-induced injury in a concentration-dependent manner,which may be associated with its antioxidant effects.

Salvianol acid A Hydrogen peroxide Oxygen free radical injury Cerebral microvascular endothelial cell

2014-08-20）

（本文编辑：杨丽）

312030 绍兴市柯桥区中医医院神经内科（易志红、陈立荪、徐峰、陈利江）；正大青春宝药业有限公司研究所（白洋）

白洋，E-mail：1651937146@qq.com