高糖对小鼠足细胞向间充质细胞转分化的影响

叶迅 侯鹏超 洪郁芝

高糖对小鼠足细胞向间充质细胞转分化的影响

叶迅 侯鹏超 洪郁芝

目的 通过观察高糖环境下小鼠足细胞表达NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的变化，探讨高糖损伤足细胞的机制。方法 将培养成熟的小鼠足细胞用RandA 1.0软件完全随机分为高糖1、2、3组（葡萄糖浓度分别为15、25和30mmol/L）和对照组（葡萄糖浓度5mmol/L），倒置显微镜下观察高糖干预前后足细胞的形态变化，采用RT-PCR和Western blot技术分别检测足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的mRNA和蛋白表达变化。结果 与对照组相比，高糖环境下培养48h后，足细胞形态发生不同程度变化。NEPH1和Smad7的mRNA表达较对照组显著减少（P＜0.05或0.01），desmin和TGF-β1的mRNA表达较对照组增加（P＜0.05或0.01）。其中高糖2组的NEPH1和Smad7的蛋白表达较对照组显著减少（均P＜0.01），而desmin和TGF-β1的蛋白表达较对照组显著增加（P＜0.01）。小鼠足细胞在高糖培养下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA的表达和Smad7 mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.996，P＜0.01）。结论 高糖可能通过激活TGF-β/Smad信号通路诱导小鼠足细胞发生表型转化。

高糖 足细胞 表型转化 NEPH1 Smad7

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes.Methods Matured mouse podocytes were cultured and randomly divided into controlgroup(5mmol/LD-glucose)and different high glucose groups(15,25 and 30 mmol/L D-glucose,respectively)by means of RandA1.0 randomized software.Morphological changes of podocytes were examined with inverted microscope and expression changes of NEPH1,desmin,TGF-β1 and Smad7 mRNAand protein were detected by RT-PCR and Western blot,respectively.Results Matured podocytes incubated with high glucose were converted from arborized cells into cobblestone appearance after 48h culture.Compared with the control group,the expression ofNEPH1 and Smad7 mRNA in pedocytes cultured with different high glucose were significantly decreased (P＜0.05 or 0.01);meanwhile,the expressions ofdesmin and TGF-β1mRNAin pedocytes cultured with different doses ofhigh glucose were significantly increased in comparison with those ofcontrolgroup(P＜0.05 or 0.01).The protein expressions ofNEPH1 and Smad7 were significantly decreased while those ofdesmin and TGF-β1 were significantly increased in 25mmol/Lglucose group compared with control group(P＜0.01).The expression of NEPH1 mRNA was negatively correlated with that of desmin mRNA (r=-0.993,P＜0.01)and TGF-β1mRNA(r=-0.989,P＜0.01).The expression ofTGF-β1 mRNAwas negatively correlated with that ofSmad7 mRNAin mouse podocyte exposed to high glucose (r=-0.996,P＜0.01).Conclusion The phenotypic transformation of mouse podocytes can be possibly induced by high glucose via activating the TGF-β/Smad signalpathway.

目前已知足细胞脱落或凋亡是导致糖尿病肾病发生进行性肾小球硬化和肾脏纤维化的关键因素[1]。近年来的研究显示，成熟足细胞的上皮细胞样表型标志蛋白在高糖环境、糖基化终产物等有害刺激诱导下，表达下降或消失，向间充质细胞转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），即足细胞丧失特异性标志物，发生表型转化，是其脱落或凋亡的关键病理学变化，也是导致足细胞功能紊乱和产生蛋白尿的潜在病理机制[2-3]。TGF-β/Smad信号通路在足细胞EMT过程中起重要的调节作用[4]。Smad7是TGF-β/Smad信号通路中起负反馈作用的分子，一旦Smad7的表达量明显减少，TGF-β/ Smad信号通路的活性会增强，从而启动足细胞EMT。本研究通过观察不同浓度高糖体外干预小鼠足细胞发生EMT，及对TGF-β/Smad信号通路的影响，探讨高糖诱导足细胞转分化的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验对象及试剂 小鼠足细胞（英国伦敦大学国王学院Guy′s医院赠送），RPMI 1640培养液、胎牛血清（FBS，美国GIBCO公司），γ-干扰素（美国PEPROTECH公司），葡萄糖（中国大冢制药有限公司）。Trizol提取试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），RCR引物（上海生工生物工程公司）。NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7抗体（美国SANTA CRUZ公司），蛋白Marker（美国Thermo公司），SDSPAGE凝胶试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠足细胞的复苏、冻存与传代 复苏-196℃液氮罐冻存的小鼠足细胞，0.25%胰蛋白酶液1ml室温下消化，细胞变圆、细胞间隙增宽时终止消化，置33℃、5% CO2培养箱孵育，待细胞长至80%～90%融合时再传代培养。

1.2.2 小鼠足细胞培养 将复苏的小鼠足细胞转入含有5ml 10%FBS1640培养液的25cm2培养瓶，每瓶加入500U γ-干扰素。置33℃、5%CO2培养箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培养箱分化成熟。将成熟的足细胞以4×104/cm2的密度接种于25cm2培养瓶中，待细胞长至80%～90%融合时再次传代，直到在37℃培育箱中培养满14d。

1.2.3 高糖干预小鼠足细胞 37℃培养满14d，细胞处于70%～80%融合时，加入无血清培养液饥饿24h使细胞同步化后根据10%FBS1640培养液要求，分别配置成含有5、15、25和30mmol/L的葡萄糖细胞培养液。将分化成熟为树枝状的小鼠足细胞20瓶，采用RandA 1.0软件完全随机分组法分为4组：高糖1、2、3组（葡萄糖浓度分别为15、25和30mmol/L）和对照组（葡萄糖浓度5mmol/L），每组5瓶足细胞在不同浓度的葡萄糖培养液中培养。37℃、5%CO2培养箱孵育48h后供检测各组足细胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7的表达。

1.2.4 RT-PCR半定量检测小鼠足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH mRNA的表达 Trizol试剂和氯仿抽提足细胞总RNA，微量核酸测量仪（美国Thermo公司）测定每个RNA样品的浓度（ng/μl）；逆转录酶M-MulV催化下合成cDNA；在DNA自动扩增仪上进行PCR反应。25μl反应体系中含10×buffer 2.5μl，dNTP 10μl，引物正反义链各10μl，TaqDNA聚合酶1.25U，cDNA 1μl，加去离子水至终体积25μl。PCR引物均根据已知的小鼠NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH设计，见表1。试验重复3次。

表1 PCR引物序列

1.2.5 扩增反应条件 在94℃2min进行预变性后，NEPH1：94℃30s、56.9℃30s、72℃30s，进行35个循环。desmin：95℃3min，进入循环，94℃30s、58.7℃30s、72℃60s，进行34个循环。TGF-β1：94℃30s、59.6℃30s、72℃60s，进行33个循环。Smad7：94℃30s、59.1℃30s、72℃60s，进行35个循环。GAPDH：94℃30s、59.8℃30s、72℃30s，进行25个循环。完成循环后，在72℃2min进行终延伸。阴性对照以双蒸水替代cDNA。各PCR产物与DNA Marker（上海生工生物工程公司）在1.7%琼脂糖凝胶（含0.5μg/ml溴化乙锭），0.5%TBE液中电泳（100V，30min），用Bio-Rad凝胶成像系统成像，凝胶定量软件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH为内参照基因，比较各目的基因条带与内参照基因条带的光密度比值。

1.2.6 Western blot检测高糖2组和对照组小鼠足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7蛋白的表达 用RIPA冰上提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按照测定浓度添加4×上样缓冲液和双蒸水，使蛋白上样量为20μg，并使上样体积达到20μl。取各组细胞蛋白在100℃变性5min，然后与Marker一起行SDS-PAGE电泳，后湿转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1h后与NEPH1、desmin、TGF-β1、Smad7和GAPDH兔抗小鼠一抗抗体（稀释度分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000和1∶10 000）结合，洗膜后与山羊抗兔IgG（目的蛋白1∶5 000，内参1∶40 000）杂交1h，洗膜后显影。凝胶定量软件Quantity-one扫描其光密度值，以NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7条带与内参GAPDH条带的光密度值之比值代表目的蛋白的相对含量。试验重复3次。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用Tamhane检验；相关性分析采用Pearson相关。

2 结果

2.1 小鼠足细胞在不同温度条件下形态变化 见图1（插页）。

由图1可见，在33℃条件下细胞呈现“鹅卵石状”，胞体较小，在小鼠γ-干扰素诱导下不断地增生传代；在37℃条件下，经1～2周逐渐长出足突，胞体变大，足突与足突之间相互连接，足细胞逐渐分化成熟为“树枝状”。

2.2 各组足细胞 NEPH1、desmin、TGF-β1和 Smad7 mRNA的表达 见表2、图2。

表2 各组足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表达

图2 各组足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7 mRNA的表达电泳图（M：标准参照物；A：对照组；B：高糖1组；C：高糖2组；D：高糖3组）

由表2可见，与对照组相比，在不同浓度的高糖培养液孵育48h后，足细胞NEPH1和Smad7 mRNA表达显著减少差异均有统计学意义（均P＜0.05或0.01），且NEPH1 mRNA的表达以高糖2组减少最明显，高糖3组的表达反而较高糖2组增加（P＜0.05）；Smad7 mRNA表达在高糖2、3组之间无统计学差异（P＞0.05），但与高糖1组相比表达显著减少差异均有统计学意义（均P＜0.01）。不同浓度高糖组足细胞desmin和TGF-β1 mRNA的表达较对照组显著增多（P＜0.05或0.01）。高糖2、3组之间desmin mRNA和TGF-β1 mRNA的表达无统计学差异（P＞0.05），但两者均较高糖1组显著增多（均P＜0.01）。

2.3 对照组和高糖2组小鼠足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表达 见表3、图3。

表3 对照组和高糖2组小鼠足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表达

图3 对照组和高糖2组小鼠足细胞NEPH1、desmin、TGF-β1和Smad7蛋白的表达

由表3可见，与对照组相比，高糖2组小鼠足细胞在25mmol/L高糖培养液孵育48h后，表达NEPH1和Smad7蛋白显著减少而desmin和TGF-β1蛋白显著增加，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.4 两因素间的相关性分析 小鼠足细胞在浓度从低到高的葡萄糖培养下NEPH1 mRNA和desmin mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.993，P＜0.01）；NEPH1 mRNA和TGF-β1 mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.989，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和desmin mRNA的表达呈显著正相关（r=0.991，P＜0.01）；TGF-β1 mRNA和Smad7 mRNA的表达呈显著负相关（r=-0.996，P＜0.01）。

3 讨论

晚近的研究发现足细胞的脱落和凋亡明显滞后于蛋白尿的发生，当糖尿病大鼠模型中出现明显的微量白蛋白尿时，肾小球足细胞的数量并没有明显的改变。导致早期足细胞功能受损、形成蛋白尿的机制可能和足细胞在持续的高糖环境诱导下，上皮细胞样表型标志蛋白表达下降或消失，向EMT有关，而后期出现的大量蛋白尿则与足细胞脱落和凋亡有关，并且足细胞EMT是脱落和凋亡之前的一个可逆过程。足细胞发生EMT时，将失去成熟足细胞的上皮细胞样表型标志物，而表达上调间充质细胞样表型标志物。表型转化为间充质细胞样的足细胞凋亡增多，且和肾小球基底膜的黏附力下降。导致足突融合、引发蛋白尿。在以蛋白尿为特征的糖尿病肾病发生发展过程中，EMT可能是导致足细胞功能失调和蛋白尿的共同始发途径。若深入研究其发生机制，并阻断调节该过程的信号转导通路，将会有效逆转足细胞的EMT，从而减轻肾小球滤过屏障损伤、减少糖尿病肾病蛋白尿。

NEPH1是裂孔隔膜上的重要的组成蛋白和信号分子，当基因突变或者蛋白缺失时会破坏裂孔隔膜的完整性，导致足突融合、蛋白尿。越来越多的临床和动物研究提示NPHS1基因编码的nephrin蛋白参与糖尿病肾病足细胞EMT过程，虽然NEPH1和nephrin有相似的结构和亚细胞定位，两者的基因缺失均可导致足突融合、蛋白尿[5]。但在高糖环境下NEPH1是否参与足细胞EMT目前尚缺乏实验证据。当足细胞因各种原因发生损伤时，可大量表达desmin蛋白并发生表型转化。后者可作为光镜下足细胞损伤的标志性蛋白。

本研究发现不同浓度高糖培养48h后，小鼠足细胞与对照组相比形态、表型均发生明显变化；NEPH1 mRNA表达显著减少，desmin mRNA表达显著增多，从低到高浓度葡萄糖培养下NEPH1和desmin mRNA的表达呈显著负相关；与对照组相比，高糖2组NEPH1的蛋白表达显著减少，而desmin的蛋白表达则显著增加；均表明足细胞在高糖诱导下发生了EMT。此外，本研究观察到小鼠足细胞发生EMT的程度并非呈葡萄糖浓度依赖性增加，NEPH1 mRNA表达减少以高糖2组最明显，在高糖3组NEPH1 mRNA表达反而有所上调，desmin mRNA表达增加在这两组之间无统计学差异，NEPH1这种表达上调是否与NEPH1相关信号转导的上下游分子调节有关，值得研究。

TGF-β是诱导足细胞和小管上皮细胞EMT的主要介质，在介导EMT中发挥着至关重要的作用。糖尿病肾病患者和小鼠模型纤维化的肾脏均普遍存在TGF-β表达的上调[6]。目前认为高糖可通过TGF-β/Smad信号途径介导足细胞损伤。Smad7是TGF-β/Smad信号通路中起负反馈作用的分子，一旦Smad7的表达量减少，该通路活性会增强。研究发现高糖诱导近曲小管上皮细胞Smad7的表达下调可能是肾脏近曲小管发生EMT的启动因素[7]。

本研究发现与对照组相比，不同浓度高糖培养48h后小鼠足细胞Smad7 mRNA表达显著减少，TGF-β1mRNA表达显著增多，从低到高浓度葡萄糖培养下TGF-β1和Smad7的表达呈显著负相关；高糖2组足细胞Smad7的蛋白表达较对照组显著减少，而TGF-β1的蛋白表达较对照组显著增加。提示高糖可能通过诱导Smad7表达下调后激活TGF-β/Smad信号途径，启动足细胞发生EMT。此外，本研究观察到小鼠足细胞Smad7 mRNA表达下调和TGF-β1 mRNA表达增加并非呈葡萄糖浓度依赖性，在高糖2、3组表达无统计学差异，提示高糖诱导小鼠足细胞EMT作用似乎存在一个浓度平台期。

综上所述，高糖诱导小鼠足细胞转分化是导致早期

足细胞功能受损、糖尿病肾病早期微量蛋白尿发生的病理机制。同时，Smad7表达下调可能是高糖激活TGF-β/ Smad信号途径，促使足细胞转分化的因素之一。因此，研发抑制TGF-β/Smad信号通路的活化，靶向保护足细胞的药物，有望在糖尿病肾病早期抑制甚至部分逆转足细胞的EMT，延缓蛋白尿的发生。

[1]Najafian B,Alpers C E,Fogo A B,et al.Pathology of human diabetic nephropathy[J].Contrib Nephrol,2011,170(6):36-47.

[2]Pinhal C S,Lopes A,Torres D B,et al.Time-course morphological and functional disorders of the kidney induced by long-term high-fat diet intake in female rats[J].Nephrol Dial Transplant, 2013,28(10):2464-2476.

[3]Boini K M,Xia M,Xiong J,et al.Implication of CD38 gene in podocyte epithelial-to-mesenchymal transition and glomerular sclerosis[J].J Cell Mol Med,2012,16:1674-1685.

[4]Dai H Y,Zheng M,Lv L L,et al.The roles of connective tissue growth factor and integrin-linked kinase in high glucose-induced phenotypic alterations of podocytes[J].J Cell Biochem, 2012,113(1):293-301.

[5]Heikkila E,Ristola M,Havana M,et al.Trans-interaction of nephrin and Neph1/Neph3 induces cell adhesion that associates with decreased tyrosine phosphorylation of nephrin[J].Biochem J,2011,435(3):619-628.

[6]Lee H S.Mechanisms and consequences of TGF-β overexpression by podocytes in progressive podocyte disease[J].Cell Tissue Res,2012,347(1):129-140.

[7]Hsieh P F,Liu S F,Lee T C,et al.The role of IL-7 in renal proximal tubule epithelial cells fibrosis[J].Mol Immunol,2012,50(1-2): 74-82.

（本文编辑：章洁）

本刊可直接用缩写的常用词汇

Impact of high-glucose on epithelial-mesenchymal transition in mouse podocytes

YE Xun,HOU Pengchao,HONG Yuzhi.
Department of Endocrinology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou 310007，China

High glucose Podocyte Phenotypic transformation NEPH1 Smad7

白细胞介素（IL）变异系数（CV）丙氨酸转氨酶（ALT）丙型肝炎病毒（HCV）磁共振成像（MRI）蛋白质印迹（Western blot）低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）动脉血氧二氧化碳分压（PaCO2）动脉血氧分压（PaO2）辅助性T淋巴细胞（Th）干扰素（IFN）甘油三酯（TG）高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）核因子-κ（NF-κB）红细胞沉降率（ESR）活化部分凝血活酶时间（APTT）获得性免疫缺陷综合征（AIDS）甲型肝炎病毒（HAV）接受者操作特征曲线（ROC曲线）精制结核菌素试验（PPD）磷酸盐缓冲液（PBS）酶联免疫吸附测定（ELISA）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）凝血酶时间（TT）凝血酶原时间（PT）曲线下面积（AUC）人类免疫缺陷病毒（HIV）肾小球滤过率（GFR）食品药品管理局（FDA）世界卫生组织（WHO）随机对照试验（RCT）胎牛血清（FBS）体重指数（BMI）天冬氨酸转氨酶（AST）纤维蛋白原（Fb）血管性血友病因子（vWF）血红蛋白（Hb）严重急性呼吸综合征（SARS）乙型肝炎病毒（HBV）乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）乙型肝炎病毒e抗体（抗-HBe）乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）直接胆红素（DBil）肿瘤坏死因子（TNF）重症监护病房（ICU）自然杀伤细胞（NK细胞）总胆固醇（TC）总胆红素（TBil）最小抑菌浓度（MIC）

2014-09-25）

浙江省中医药科学研究基金计划（2012ZA097）；杭州市科委医疗卫生及重点专科专病科研攻关专项（20130733Q16）

310007 杭州市中医院内分泌代谢科

洪郁芝，E-mail：hyzhcy@aliyun.com