帕立骨化醇对糖尿病肾病肾小管上皮间充质转化的干预作用研究

王来亮 罗群 蔡珂丹 周芳芳 高燕红

帕立骨化醇对糖尿病肾病肾小管上皮间充质转化的干预作用研究

王来亮 罗群 蔡珂丹 周芳芳 高燕红

目的 探讨帕立骨化醇对糖尿病肾病（DKD）肾小管上皮间充质转化（EMT）的作用及内在机制。方法 将24只SD大鼠按随机数字表法分为帕立骨化醇干预组（P组）、糖尿病肾病组（D组）和正常对照组（C组），每组各8只。P组和D组大鼠腹腔注射链脲佐菌素65mg/kg建立糖尿病肾病模型，造模成功后第2天P组腹腔注射帕立骨化醇（溶于丙二醇中）0.4μg/kg，3次/周，D组予等体积丙二醇；C组仅予等体积丙二醇。4周后测血、尿生化指标；进行肾脏病理学检查；免疫组化及Western blot技术检测肾组织E-钙粘蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤连蛋白（FN）、转化生长因子-β1（TGF-β1）及Klotho的表达，并进行指标间的相关性分析。结果 D组大鼠血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白水平均高于C组，P组均低于D组（均P＜0.05）。C组大鼠肾小管结构完整清晰，无明显病理改变；D组可见肾小管间质局部炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞脱落，小管扩张，基底膜断裂；P组肾小管间质病理改变较D组减轻。D组大鼠肾组织E-cadherin与Klotho表达低于C组，而P组高于D组（均P＜0.05）；与C组比较，D组大鼠肾组织α-SMA、FN及TGF-β1表达增加，而P组表达均较D组减少（均P＜0.05）。Klotho表达与E-cadherin呈正相关（r=0.924，P＜0.05），而与α-SMA、FN及TGF-β1均呈负相关（r=-0.806、-0.623、-0.856，均P＜0.05）。结论 帕立骨化醇可抑制糖尿病肾病大鼠肾小管上皮EMT，其作用可能与增加肾组织Klotho表达，同时减少TGF-β1合成相关。

帕立骨化醇 糖尿病肾病 上皮间充质转化 转化生长因子-β1 Klotho

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of parlicalcitol on tubular epithelial mesenchymal transition(EMT) and underlying mechanism in diabetic kidney disease(DKD). Methods DKD was induced by single intraperitoneal injection of 65 mg/kg streptozotocin(STZ)in 16 Sprague Dawley(SD)rats,then the animals were randomly divided into group P and group D with 8 in each.Rats in group P received intraperitoneal injection of paricalcitol(0.4μg·kg-1)in propylene glycol three times a week;rats in group D received intraperitoneal injection of same volume of propylene glycol;8 rats in group C served as normal control and received propylene glycol as in group D.Blood,urine and renal tissue samples were collected after 4 weeks intervention of paricalcitol or vehicles.Biochemical indexes were measured,renal tissue was examined histopathologically and the expression of E-cadherin,alpha-smooth muscle actin(α-SMA),fibronectin(FN),transforming growth factor-β1(TGF-β1)and klotho in renal tissue were measured with immunohistochemistry and Western blotting,respectively.In addition,the correlation among the indexes was analyzed. Results Scr,BUN and 24 h urine protein increased significantly in group D compared with group C,while decreased in group P compared with group D(all P＜0.05). Local inflammatory cell infiltration,tubular epithelial cell detachment,tubular expansion and basement membrane rupture were observed in group D,but attenuated in group P compared with group C.The expression of E-cadherin and klotho decreased,while α-SMA,FN and TGF-β1 increased in group D compared with group C(all P＜0.05).Compared with D,the expression of E-cadherin and klotho increased,while α-SMA,FN and TGF-β1 decreased in group P(all P＜0.05).The expression of klotho was negatively correlated with α-SMA,FN and TGF-β1,while was positively correlated with E-cadherin(r=-0.806,P＜0.05;r=-0.623,P＜0.05;r=-0.856,P＜0.05;r=0.924,all P＜0.05). Conclusion Paricalcitol can inhibit tubular EMT in DKD,which may be associated with its effect of upregulating Klotho expression,and inhibiting TGF-β1 synthesis.

【Key words】 ParicalcitolDiabetic kidney disease Epithelial mesenchymal transition TGF-β1 Klotho

糖尿病肾病为糖尿病患者主要的微血管病变之一，在我国已迅速上升为终末期肾病（ESRD）的重要原因。在糖尿病肾病中，肾小管间质改变，包括肾小管上皮间充质转化（EMT），并非继发于肾小球病变，而是其早期及原始特征之一[1-2]。既往研究发现，EMT与肾小管间质纤维化密切相关[3-4]；伴随着EMT，糖尿病肾病肾小管间质纤维化不断进展，最终可发展为ESRD[5]。Klotho与转化生长因子-β（TGF-β）信号通路的相互调控，共同参与了肾小管上皮EMT[6-8]。因此，通过调控肾组织Klotho的表达及TGF-β信号通路的传导或可成为抑制糖尿病肾病肾小管上皮EMT的重要途径。帕立骨化醇为新型的维生素D类似物，具有抑制肾小管间质纤维化的作用[9]，但其对糖尿病肾病肾小管上皮EMT的作用及机制尚未阐明。笔者采用帕立骨化醇干预糖尿病肾病大鼠模型，以探讨其对肾小管上皮EMT的作用及可能机制，最终为糖尿病肾病肾小管间质纤维化的防治提供新线索，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物与主要试剂 雄性Sprague Dawley（SD）大鼠24只，清洁级封闭群，体重200～220g，由浙江省动物中心提供，于宁波大学实验动物中心饲养。兔抗Klotho多克隆抗体（美国Prosci公司），兔抗TGF-β1多克隆抗体、兔抗E-钙粘蛋白（E-cadherin）多克隆抗体、兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体、兔抗纤连蛋白（FN）多克隆抗体及兔抗β-actin多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG荧光二抗（美国Odyssey公司），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司），帕立骨化醇（美国Abbott公司），免疫组化检测试剂盒（武汉博士德），DAB显色试剂盒（武汉博士德）。

1.2 动物模型的建立与分组 大鼠适应性喂养1周，按随机数字表发分为帕立骨化醇干预组（P组）、糖尿病肾病组（D组）、正常对照组（C组），各8只。P组和D组大鼠禁食12h后单次无菌腹腔注射1%STZ（65mg/ kg）。1%STZ溶液临用前用0.1mmol/L柠檬酸-柠檬酸二钠缓冲液（pH=4.5）配制，30 min内注射完毕。72h后夜间禁食≥8h，晨起断尾取血测空腹血糖，空腹血糖≥16.7mmol/L并能维持1周确定为糖尿病模型；3周后测尿蛋白≥30mg/24h确定为糖尿病肾病造模成功。16只大鼠糖尿病肾病造模全部成功。P组：帕立骨化醇溶于丙二醇中，于造模成功后第2天腹腔注射0.4 μg/kg，3次/周，连续4周；D组：于造模成功后第2天给予等体积的丙二醇腹腔注射；C组：按D组方法腹腔注射丙二醇。

1.3 标本收集 连续干预4周后大鼠禁食≥8h，代谢笼收集24h尿液，记录尿量后留取样品5ml，2 000r/min离心10min，取上清液待检。用10%水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后处死大鼠，心脏采血3～5ml，3 500r/min离心10min，留取血清待检。采血后立即开腹取双肾，清除肾蒂结缔组织及肾脏包膜，纵向剖开肾脏：取部分组织置于4%多聚甲醛溶液固定24h，常规脱水、透明，石蜡包埋；其余肾组织用液氮冻存。

1.4 生化指标检测 血糖采用快速血糖仪检测；血清肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、24h尿蛋白、血钙、血磷及全段甲状旁腺激素（iPTH）采用美国Beckcoulter Uni－Cel DxC 800 Synchron全自动生化分析仪检测。

1.5 肾脏病理学检查 肾组织石蜡切片（厚3～4μm），进行常规HE染色。光镜下观察肾脏组织形态结构的变化。

1.6 免疫组化 肾组织石蜡切片（厚3～4μm），脱蜡、水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，微波修复抗原，5%BSA封闭；分别滴加Klotho（1∶300）、TGF-β1（1∶200）、E-Cadherin（1∶200）、α-SMA（1∶100）和FN（1∶100）一抗，4℃孵育过夜；滴加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，显微镜下控制DAB显色；苏木素复染，脱水、透明并封片。采用PBS替代一抗作阴性对照；Image-pro plus 6.0图像分析软件对蛋白的表达进行半定量分析：每张切片随机选取10个不重复视野（×200），分别检测每个视野中指标的阳性区积分光密度（IOD），并取IOD均值作为阳性物质的相对表达量。

1.7 Western blot 取液氮冻存的肾组织，加适量裂解液后充分研磨，4℃裂解组织，12 000g低温离心2min，取上清液，BCA法测蛋白浓度；取总蛋白30μg，100℃加热变性5 min后上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，并湿转至PVDF膜；5%BSA室温封闭2h，加入Klotho（1∶400）、TGF-β1（1∶200）、E-cadherin（1∶200）、α-SMA（1∶200）和FN（1∶200）一抗，4℃孵育过夜；加荧光标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000）室温反应1h后，采用Odyssey红外激光成像系统扫描成像，并测量条带灰度值，以β-actin为内参，进行定量分析。

1.8 统计学处理 应用Stata 12.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析；相关性分析采用Pearson直线相关。

2 结果

2.1 各组大鼠生化指标的比较 糖尿病肾病第4周，D组空腹血糖水平显著高于C组（P＜0.05），但与P组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；D组Scr、BUN及24 h尿蛋白水平均高于C组和P组（均P＜0.05）；与C组比较，D组血磷与iPTH水平均上升，血钙水平下降，但P组血磷与iPTH水平均低于D组，血钙水平高于D组（均P＜0.05），详见表1。

表1 各组大鼠生化指标的比较

2.2 各组大鼠肾脏病理学检查结果的比较 C组大鼠肾小管结构完整清晰，无明显病理改变；D组可见肾小管间质局部炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞脱落，小管扩张，基底膜断裂；P组肾小管间质病理改变较D组减轻，见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理学改变（A：C组；B：D组；C：P组；HE染色，×200）

2.3 各组大鼠肾组织E-cadherin、α-SMA及FN表达的比较 免疫组化结果显示：与C组比较，D组肾小管E-cadherin表达下调，IOD降低（P＜0.05），而肾小管间质α-SMA与FN表达上调，IOD升高（均P＜0.05）；与D组比较，P组E-cadherin表达上调，IOD升高（P＜0.05），而α-SMA与FN的表达下调，IOD降低（均P＜0.05），详见图2。Western blot结果显示：D组肾组织E-cadherin较C组显著减少（0.78±0.10、1.06±0.10，P＜0.05），而α-SMA与FN表达增加（0.77±0.08、0.24±0.10，0.83±0.06、0.64±0.05，均P＜0.05）；与D组比较，P组E-cadherin表达增加（0.92±0.05、0.78±0.10，P＜0.05），而α-SMA及FN表达减少（0.55±0.10、0.77±0.08，0.75± 0.04、0.83±0.06，均P＜0.05），详见图3。

2.4 各组大鼠肾组织TGF-β1的表达 免疫组化结果显示：与C组比较，D组肾小管间质TGF-β1表达上调，IOD升高（P＜0.05）；而P组TGF-β1表达较D组下调，IOD降低（P＜0.05），见图4。Western印迹结果显示：与C组比较，D组肾组织TGF-β1表达增加（0.69± 0.05、0.38±0.06，P＜0.05），而P组较D组表达减少（0.55±0.06、0.69±0.05，P＜0.05），见图5。 2.5 各组大鼠肾组织Klotho表达的比较 免疫组化结果显示：C组Klotho在肾小管呈高表达，IOD升高；与C组比较，D组肾小管Klotho表达显著下调，IOD降低（P＜0.05）；而P组Klotho表达较D组上调，IOD升高（P＜0.05），见图6。Western印迹结果显示：与C组比较，D组肾组织Klotho表达减少（0.65±0.10、1.04±0.04，P＜0.05），而P组较D组表达增加（0.95±0.04、0.65± 0.10，P＜0.05），见图7。

2.6 肾组织Klotho表达与E-cadherin、α-SMA、FN及TGF-β1表达的相关性分析 相关性分析发现，Klotho与E-cadherin呈正相关（r=0.924，P＜0.05），而与α-SMA、FN及TGF-β1呈负相关（r=-0.806、-0.623、-0.856，均P＜0.05）。

3 讨论

早在20年前，在抗肾小管基底膜病动物模型中，研究发现小管上皮细胞可表达纤维化特异性标志蛋白——成纤维细胞特异蛋白-1（FSP-1），首次揭示了EMT与肾脏纤维化的内在联系[10]。在5/6肾切除动物模型中也发现，肾小管上皮细胞EMT可促进小管间质纤维化[3]。之后，在UUO动物模型中，利用基因标记的方法明确肯定了近端肾小管上皮细胞EMT在慢性肾脏病进展中的作用。研究表明，肾小管间质中高达36%的成纤维细胞源于近端小管上皮细胞EMT[4]。类似动物模型，在不同肾脏病患者的肾活检组织中均存在肾小管上皮细胞EMT，表现为部分上皮细胞出现表型转化，且与Scr水平及小管间质纤维化相关[11-12]。

图2 各组大鼠肾组织E-cadherin、α-SMA及FN的表达（A：免疫组化，×200；B：IOD；注：与C组比较，*P＜0.05；与D组比较，△P＜0.05）

在糖尿病肾病中，肾小管间质改变，包括EMT，并非继发于肾小球病变，而是早期病变及原始特征之一，无论从发病时间还是发病机制，肾小管病变有其独立性，且肾小管病变和肾间质纤维化对肾功能的预后较肾小球病变更为重要[1-2]。伴随着EMT，糖尿病肾病肾小管间质纤维化不断进展，最终可发展为ESRD[5]。本研究结果发现，糖尿病肾病第4周大鼠肾小管上皮标志蛋白E-cadherin表达减少，而间充质标志蛋白α-SMA及FN表达增加，提示肾小管上皮正发生EMT，与之前报道一致[13]。此外，本研究中糖尿病肾病大鼠伴有不同程度的肾小管间质形态学改变。值得注意的是，糖尿病肾病大鼠经帕立骨化醇连续干预4周后，大鼠肾小管上皮EMT及小管间质改变减轻，同时伴肾功能改善，且未发生高钙血症，表明帕立骨化醇治疗可改善糖尿病肾病肾脏预后。

图3 各组大鼠肾组织E-cadherin、α-SMA及FN的表达

在肾脏疾病中，多种因素可诱导肾小管上皮EMT的发生，包括低氧环境、活性氧（ROS）、血管活性因子、糖基化终末产物（AGEs）、促纤维化细胞因子以及基质金属蛋白酶等。其中，TGF-β1是促进肾小管上皮EMT的主要因子之一[14-15]。Burns等[13]研究发现，TGF-β1诱导肾小管上皮细胞（NRK-529）发生EMT，E-cadherin、α-SMA及波形蛋白表达水平相应改变；与之对应，在糖尿病肾病大鼠模型中，TGF-β1水平升高，上皮标志蛋白E-cadherin表达减少，而间充质标志蛋白α-SMA与胶原蛋白表达增加。此外，在其他多项研究中均证实了此结果[16-17]。本研究中，糖尿病肾病第4周大鼠肾组织TGF-β1的表达增加，伴E-cadherin表达减少，α-SMA及FN表达增加；而帕立骨化醇干预后，肾组织TGF-β1的表达减少，同时伴EMT相关蛋白的表达逆转。此结果提示，帕立骨化醇干预可通过减少TGF-β1的表达，从而抑制糖尿病肾病肾小管上皮EMT。

图4 各组大鼠肾组织TGF-β1的表达（A：C组；B：D组；C：P组；免疫组化，×200；与C组比较，*P＜0.05；与D组比较，△P＜0.05）

图5 各组大鼠肾组织TGF-β1的表达

图6 各组大鼠肾组织Klotho蛋白的表达（A：C组；B：D组；C：P组；免疫组化，×200；与C组比较，*P＜0.05；与D组比较，△P＜0.05）

图7 各组大鼠肾组织Klotho的表达

此外，CKD患者早期即可出现Klotho缺乏[18]，而影响Klotho基因表达的一个关键因素就是高糖环境[19]。体内外研究表明，高糖降低肾脏Klotho表达水平，而降糖可逆转Klotho表达[19]。Klotho缺乏与肾小管间质纤维化密切相关。研究表明，在单侧输尿管梗阻（UUO）动物模型中，肾脏Klotho缺乏可加重肾小管间质纤维化，TGF-β1、α-SMA及FN表达明显增加[7]；而外源性Klotho可抑制肾小管间质纤维化，这可能与Klotho直接与TGF-β1Ⅱ型受体结合从而抑制TGF-β1信号通路的传导有关[7-8]。可见，Klotho缺乏可促进肾小管间质纤维化，而抑制TGF-β1的表达及其信号通路的传导可能是其内在机制之一。值得注意的是，TGF-β1的表达除了受Klotho调控外，本身还可抑制组织对Klotho的表达[7-8]。本研究结果显示，在糖尿病肾病第4周，大鼠肾组织Klotho表达明显减少，同时伴TGF-β1表达增加，而予帕立骨化醇干预后，可逆转肾组织Klotho及TGF-β1的表达。此结果提示，在糖尿病肾病状态下，帕立骨化醇可通过促进肾组织Klotho的表达，从而抑制TGF-β1介导的肾小管上皮EMT及肾脏纤维化。

总之，糖尿病肾病中Klotho及TGF-β信号通路相互调控，而Klotho表达水平下降引起TGF-β1合成增加是导致肾小管上皮EMT的重要机制。因此，通过调控肾组织Klotho表达，从而抑制TGF-β1合成，成为帕立骨化醇阻断肾小管上皮EMT及小管间质纤维化的内在途径之一。但目前帕立骨化醇对肾脏Klotho表达的调控机制尚未阐明，可能是由多个维生素D反应元件（VDREs）介导[20]，仍需进一步研究。

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Effect of paricalcitol on tubular epithelial mesenchymal transition in diabetic kidney disease

WANG Lailiang,LUO Qun,CAI Kedan,et al.
Department of Nephrology,Ningbo Second Municipal Hospital,Ningbo 315010,China

2014-12-15）

（本文编辑：严玮雯）

浙江省医药卫生科研基金（2015KYA201）；宁波市自然科学基金（2014A610245）

315010 宁波市第二医院肾内科

罗群，E-mail：nbluoqun@163.com