钙蛋白酶-10基因SNP-19与多囊卵巢综合征相关性研究

邓妙 刘元伟 张红艳 岑加萍 张治芬

●论 著

钙蛋白酶-10基因SNP-19与多囊卵巢综合征相关性研究

邓妙 刘元伟 张红艳 岑加萍 张治芬

目的 探讨钙蛋白酶-10基因（CAPN-10）单核苷酸多态性-19（SNP-19）与多囊卵巢综合征（PCOS）的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对107例PCOS患者（PCOS组）及111例健康体检者（对照组）的CAPN-10 SNP-19进行分析，并测定其性激素和生化指标。PCOS组再根据BMI与胰岛素抵抗（IR）稳态模型指数（HOMA-IR）分为肥胖组与非肥胖组、IR组与非IR组，分析CAPN-10 SNP-19与其关系。结果 与对照组相比，PCOS组BMI、空腹血糖（FPG）、TG、TC、LDL、黄体生成素（LH）、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）、睾酮（T）均升高（均P＜0.01）。PCOS组CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型频率均高于对照组（均P＜0.05）；且CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS发病风险较1/1、2/2基因型增加约2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因频率PCOS肥胖组与非肥胖组、IR组与非IR组比较均无统计学差异（均P＞0.05）；PCOS肥胖组和IR组CAPN-10 SNP-19 1/2基因型频率分别高于非肥胖组和非IR组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 CAPN-10 SNP-19与PCOS遗传易感性有关，可能与PCOS肥胖及IR无关。

多囊卵巢综合征 半胱氨酸内肽酶类，钙蛋白酶-10 多态性，单核苷酸 胰岛素抵抗

【 Abstract】 Objective To investigate the relationship between single nucleotide polymorphisms-19(SNP-19)in calpain-10 (CAPN-10)gene and polycystic ovary syndrome(PCOS). Methods One hundred and seven PCOS patients(PCOS group)and 111 healthy female subjects(control group)were recruited in the study.The distribution of CAPN-10 SNP-19 was analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Serum hormones and biochemical indicators were also measured.Oral glucose tolerance test(OGTT)was performed in PCOS group. Results The BMI,FPG,TG, TC,LDL,LH,LH/FSH and T levels were significantly increased in PCOS group compared to control group(P＜0.01).The frequency of allele 1 and genotype 1/2 of CAPN-10 SNP-19 were higher in PCOS group than those in control group.Genotype 1/2 was closely associated with PCOS compared to 1/1 and 2/2(OR=1.9,95%CI=1.1-3.3,P＜0.05).There was no significant difference in frequency of genotype 1/2 between obese group and non-obese group,between insulin resistance(IR)group and non-IR group of PCOS patients(P＞0.05). Conclusion The SNP-19 in CAPN-10 may contribute to the genetic susceptibility to PCOS,but it may be not correlate with obesity or IR of PCOS patients.

【 Key words】 Polycystic ovary syndrome Cysteine endopeptidases,CAPN-10 Polymorphism,single nucleotide Insulin resistance

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是女性常见的内分泌疾病，影响女性从青春期到绝经后整个过程的身心健康。其发病机制尚不十分清楚，但大部分研究认为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是PCOS病理生理的中心环节，约65%的PCOS患者存在IR[1]。钙蛋白酶-10基因（CAPN-10）是第1个被克隆定位的与2型糖尿病（T2DM）有关的基因，该基因的变异与IR的发生密切相关[2]。随后大量研究也证实CAPN-10与多种IR相关性疾病，如妊娠期糖尿病（GDM）、肥胖症、高血压等有关[3-5]。因为PCOS与T2DM、GDM等有共同的IR机制，所以CAPN-10也成为PCOS的重要候选基因。本研究旨在探讨CAPN-10单核苷酸多态性-19（single nucleotide polymorphisms-19，SNP-19）与PCOS的相关性，为PCOS发病的遗传因素、分子机制、临床诊断和基因治疗提供可能的实验依据。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年1月至2014年1月在杭州市第一人民医院妇科就诊的PCOS患者设为PCOS组；纳入标准：近3个月未服用避孕药或其他影响性激素水平及糖脂代谢的药物；诊断标准参照2003年ESHRE/ASRM鹿特丹会议标准[6]。另以随机数字表法选取同期来本院体检的健康女性设为对照组；纳入标准：月经周期规律，无高雄激素血症及高雄激素表现，经阴道B超检查卵巢无多囊样改变；近3个月未服用避孕药或其他影响性激素水平及糖脂代谢的药物，并排除甲状腺、肾上腺等内分泌疾病。PCOS组共107例，年龄18～34（26.7± 4.8）岁。对照组共111例，年龄21～36（27.1±4.2）岁。两组受检者年龄比较无统计学差异（P＞0.05）；均于月经第2～4天或PCOS组患者闭经期B超检查未见优势卵泡时，禁食12h后清晨空腹采静脉血进行生化指标（TG、TC、HDL、LDL）、性激素[卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）、催乳素（PRL）、睾酮（T）]测定和基因检测。PCOS组当日行糖耐量试验（OGTT）：75g葡萄糖溶于250ml水中，3min内服下，空腹及服糖后2h分别采血测定血糖、胰岛素水平。两组受检者采血当日测量身高、体重，计算BMI、胰岛素抵抗稳态模型指数（HOMA-IR），HOMA-IR=[空腹血糖（FPG，mmol/L）×空腹胰岛素（mIU/L）]/22.5。PCOS组再根据HOMA-IR分为IR组（HOMA-IR≥2.0，76例）和非IR组（HOMA-IR＜2.0，31例）；根据BMI分为肥胖组（BMI≥25，29例）和非肥胖组（BMI＜25，78例）。

1.2 方法

1.2.1 性激素及生化指标测定 性激素测定采用化学发光法（德国西门子ADVIA-centaur XP全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂）；血糖及血脂测定采用酶法（美国贝克曼-库尔特AU5800全自动生化分析仪及配套试剂）；胰岛素测定采用电化学发光法（瑞士罗氏ebol电化学发光免疫分析仪及配套试剂）。

1.2.2 CAPN-10 SNP-19基因型检测 美国AXYGEN DNA提取试剂盒提取外周血有核细胞中的基因组DNA，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）检测技术（美国Applied Biosystems-2720 PCR仪）。引物序列：上游引物 5′-GTTTGGTTCTCTTCAGCGTGGAG-3′，下游引物5′-CATGAACCCTGGCAGGGTCTAAG-3′；反应体系：25μl反应体系，1×PCR缓冲液（含Mg2+）12.5μl，2mmol/L dNTPs 2.5μl，5μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，基因组DNA 2μl，加注射用水至总体积25μl；循环条件：预变性95℃，5min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，30s；终止72℃，10min；共40个循环；PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳80V，60min跑胶；UVP凝胶成像系统拍照存图，在155bp处出现条带为缺失多态（del），等位基因记为1，在187bp处出现条带为插入多态（ins），等位基因记为2。

1.3 统计学处理 采用SPSS19.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；检测两组等位基因频率在群体中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡检验。

2 结果

2.1 PCOS组与对照组BMI及生化指标比较 见表1。

表1 PCOS组与对照组BMI及生化指标比较

由表1可见，与对照组相比，PCOS组除HDL外BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高（均P＜0.01）。

2.2 PCOS组与对照组性激素指标比较 见表2。

表2 PCOS组与对照组性激素指标比较

由表2可见，与对照组相比，PCOS组LH、LH/FSH、T均升高（均P＜0.01）；两组FSH、E2、P、PRL水平均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.3 PCOS组中肥胖组与非肥胖组血糖、胰岛素水平及HOMA-IR比较 见表3。

表3 PCOS组中肥胖组与非肥胖组血糖、胰岛素水平及HOMA-IR比较

由表3可见，与非肥胖组相比，肥胖组空腹胰岛素、HOMA-IR均显著升高（均P＜0.01）；两组FPG、服糖后2h血糖、服糖后2h胰岛素水平均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.4 PCOS组中肥胖组与非肥胖组性激素指标比较 见表4。

由表4可见，与非肥胖组相比，肥胖组LH升高（P＜0.05）；LH/FSH及T也升高，但差异无统计学意义（均P＞0.05）；两组FSH、E2、P、PRL水平均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.5 CAPN-10 SNP-10 3种基因型电泳结果 见图1。

表4 PCOS组中肥胖组与非肥胖组性激素指标比较

图1 CAPN-10 SNP-19 3种基因型电泳结果（marker：标志物；1/1：155bp片段纯合子；2/2：187bp片段纯合子；1/2：155/187bp片段杂合子）

由图1可见，本研究共检测到CAPN-10 SNP-19 1/1、1/2、2/2这3种基因型。

2.6 PCOS组与对照组CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型频率比较 见表5。

表5 PCOS组与对照组CAPN-10 SNP-19等位基因及基因型频率比较[例（%）]

由表5可见，PCOS组CAPN-10 SNP-19 1等位基因、1/2基因型频率均高于对照组（均P＜0.05）。且PCOS组、对照组CAPN-10 SNP-19基因型频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则（χ2=0.84、1.32，均P＞0.05）；CAPN-10 SNP-19 1/2基因型PCOS发病风险较1/1、2/2基因型增加约2倍（OR=1.9，95%CI=1.1～3.3，P＜0.05）。

2.7 PCOS组中肥胖组与非肥胖组、IR组与非IR组CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型频率比较 见表6。

表6 PCOS组中肥胖组与非肥胖组、IR组与非IR组CAPN-10 SNP-19等位基因、基因型频率比较[例（%）]

由表6可见，CAPN-10 SNP-19 1、2等位基因频率在肥胖组与非肥胖组、IR组与非IR组均无统计学差异（均P＞0.05）；肥胖组和IR组1/2基因型频率分别高于非肥胖组和非IR组，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

CAPN-10位于称为非胰岛素依赖型糖尿病1的染色体2q37.3中，该基因全长31 kb，含有15个外显子和14个内含子。Turner等[2]研究发现CAPN-10 mRNA除心脏外，在胰岛表达水平最高，提示CAPN-10对内分泌功能有影响。CAPN-10编码的蛋白酶属于Ca2+依赖性非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族，通过激活及自溶而表现出蛋白水解酶活性，水解在Ca2+调节信号途径中起重要作用的其他蛋白酶，从而参与细胞骨架调整、酶的修饰及多种细胞过程。目前SNP数据库已列出521个人类CAPN-10 SNP位点。在众多位点中，对SNP-19、-22、-43、-44、-56、-58、-63和-110的研究较多。其中SNP-19位于内含子6nt7919、rs3842570，是32 bp的2次或3次重复多态。Hachisu等[7]研究显示串联重复序列的数目在转录调控中发挥重要作用，可影响mRNA的稳定性，并通过改变结构修饰的蛋白质活性，从而发挥病理生理作用。

本研究结果显示PCOS组CAPN-10 SNP-19 1等位基因及1/2基因型频率高于对照组（均P＜0.05），且1/2基因型PCOS发病风险较1/1、2/2基因型增加约2倍。这提示CAPN-10 SNP-19与PCOS遗传易感性有关，是PCOS的易感基因。这与Gonzalez等[8]对西班牙PCOS患者的研究结果一致。而Dasgupta等[9]对印度南部地区PCOS患者的相关研究则表明，CAPN-10 SNP-19等位基因频率及基因型分布与PCOS无明显相关性。Vollmert等[10]对德国PCOS患者的研究表明SNP-19 2/2基因型与PCOS发病风险相关（OR=2.98）。本研究进一步统计了不同人种PCOS组CAPN-10 SNP-19次要等位基因频率，发现中国浙江地区PCOS患者次要等位基因频率1（40.2%）与西班牙PCOS患者（34.0%）[8]相近，但低于印度（54.0%）[9]、高于德国（29.0%）[10]，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。这提示CAPN-10 SNP-19等位基因分布存在种族和地域的差异。

本研究显示与对照组相比，PCOS组BMI、FPG、TG、TC、LDL均升高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。27.1%的PCOS患者存在肥胖，71.0%存在IR，且PCOS肥胖组较非肥胖组空腹胰岛素、HOMA-IR均显著升高（均P＜0.01）。研究表明，高胰岛素水平可诱导肥胖相关基因表达[11]，影响脂肪细胞分化，同时刺激食欲，从而引起肥胖；而肥胖者，游离脂肪酸、乳酸盐等代谢产物利用率增加又影响胰岛素的分泌、代谢及靶器官的敏感性，从而加重IR，形成恶性循环。肥胖及IR近期可影响PCOS患者促排卵效果及妊娠结局，远期可增加T2DM、心脑血管疾病风险。因此对PCOS合并肥胖患者，控制体重仍为首选的最基本的治疗方案。

进一步统计分析发现，PCOS肥胖组和IR组1/2基因型频率分别高于非肥胖组和非IR组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05）。究其原因可能有：（1）本研究采用HOMA-IR作为IR的评估标准，今后需要进一步测定服糖后1h血糖、胰岛素，根据曲线下面积、是否存在高峰延迟等综合评估IR，必要时完善高胰岛素正葡萄糖钳夹术（IR的金标准）。以BMI评估肥胖，今后需完善腰围、臀围、腰臀比等综合评估肥胖，并明确肥胖类型；（2）本研究中71.0%PCOS患者存在IR，非IR组仅31例，需要增加样本量以明确CAPN-10 SNP-19与PCOS IR的关系；（3）CAPN-10 SNP-19可能与PCOS肥胖及IR有关，但其相关性被CAPN-10内部影响CAPN-10转录活性的其他单核苷酸所改变。因此，今后有必要研究CAPN-10其他SNP、单倍型及单倍型组合与PCOS的相关性；（4）CAPN-10 SNP-19可改变结构修饰的蛋白质活性，SNP-19不同基因型的产物结构、组织分布及生物活性与PCOS肥胖和IR的关系有待进一步基因功能研究。

综上所述，CAPN-10 SNP-19与PCOS遗传易感性有关，是PCOS的易感基因。今后有必要进一步完善相关临床资料，扩大样本含量，综合研究CAPN-10 SNPs、单倍型及单倍型组合与PCOS发病风险、PCOS各临床表型及高危型PCOS的相关性，进而进行基因功能研究，探讨PCOS发病的遗传因素和分子机制，为临床诊断、预防和基因治疗提供理论依据。

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Association of CAPN-10 SNP-19 with polycystic ovary syndrome

DENG Miao,LIU Yuanwei,ZHANG Hongyan,et al.
Department of Gynecology and Obstetrics，Hangzhou First People′s Hospital，Hangzhou 310006,China

2014-07-03）

（本文编辑：李媚）

浙江省科技计划项目（2009C33114）

310006 杭州市第一人民医院妇产科（邓妙现在杭州市妇产科医院工作）

张治芬，E-mail：zhangzf@zju.edu.cn