香辛料提取物对枇杷灰斑病菌的抑制作用

曾志红

(莆田学院 环境与生物工程学院，福建 莆田 351100)

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl)属蔷薇科(Rosaceae)多年生双子叶植物常绿乔木，原产我国，主要分布在长江以南各省。目前，随着枇杷的广泛种植，枇杷病害越来越严重，如斑点病和角斑病和灰斑病等，其中，灰斑病是枇杷较为常见的病害，［1，2］严重地影响了枇杷的产量和质量。

据相关研究表明，生姜(Zingiber officinale Rosc.)、辣椒(Capsicum annuum L. )、花椒(Zanthoxylum bungeanum L. )和丁香(Syzygium aromaticum L. )的提取液对微生物有一定的抑制作用，［3－9］但是否对枇杷灰斑病［10］有抑制作用目前尚未见报道，本研究将为枇杷灰斑病的生物防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试香辛料植物

表1 香辛料植物

1.1.2 供试菌种与培养基

供试菌种:枇杷灰斑病菌(P.eriobotrifolia Guba)，由莆田学院生物与环境工程实验室提供。

培养基:PDA。

1.2 试验方法

1.2.1 药剂的提取

将洗净晾干的供试香辛料样品粉碎，过40 目筛，称取10g 装入250mL 三角瓶，加入100mL 蒸馏水浸泡12h，在70℃下水浴40min，然后经3000转/分离心10min，取上清液。残渣加入100mL 蒸馏水再次提取并取上清液。将两次上清液混合后浓缩至100mL，得到的药剂浓度为0.1g/mL，置于4℃下保存。

1.2.2 药效筛选

以PDA 培养基作为培养基，在25℃下将枇杷灰斑病菌培养至产孢后，再用无菌水将孢子稀释成能在10 ×10 倍视野的显微镜下观察到30－59 个分生孢子的悬浮液，取200ul 孢子悬浮液均匀涂于10mL PDA 培养基表面，凝固后再均匀放上5 个牛津杯，中间加入无菌水作为对照，周围4 个分别加入浓度为均为0.1g/mL 的生姜、辣椒、花椒和丁香的水提液，依次编号为0、1、2、3、4，重复五次试验。置于25℃恒温箱内培养3 天后，测量抑菌圈的直径，纵横各一次，取平均值。选择抑菌效果较好药剂进行进一步的抑菌性能测定。

1.2.3 抑制菌丝体生长测定

选取丁香为药品分别配制成0mg/mL，2mg/mL，4mg/mL，6mg/mL，8mg/mL，10mg/mL 的含药平板，从PDA 培养基平皿培养4 天的菌丝移至含药平板中央，3 次重复，在25℃恒温箱内培养3天后测量菌丝直径，计算抑制百分率，求出药剂丁香的毒力回归方程式及EC50和EC90。

1.2.4 抑制孢子萌发力测定

配制10mL 在10 ×10 倍视野下能观察到30 ～59 个分生孢子的孢子悬浮液，然后取1mL 孢子悬液加入0mg/mL，20mg/mL，40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL 中，以无菌水为对照，处理1 小时，然后分别移于PDA 培养基平皿上 (1mL/皿)，在25℃恒温箱内培养，观察孢子萌发情况，求出每种药剂的毒力回归方程式及EC50和EC90。

2 结果与分析

2.1 几种不同植物的药效的筛选

由试验结果可看到:生姜、辣椒、花椒、丁香水提液周围均有大小不等的抑菌圈，说明这四种水提物对枇杷灰斑病菌丝的生长均具有抑制作用，而且抑菌圈直径大小顺序为丁香＞辣椒＞生姜＞花椒(见表2)，可见丁香的抑菌效果最好。

表2 四种水提物对枇杷灰斑病菌的影响

2.2 抑制菌丝体生长测定

由结果可知丁香水提液对枇杷灰斑病菌丝的生长具有抑制作用(见图1)，其抑制作用随着水提液浓度的减小而减弱(见表3)，通过DPS 软件分析可得，抑制菌体生长机率值(y)随丁香对数浓度(x)变化的关系式为y =3.6437 +1.2979x，相关系数r 为0.9895，说明抑菌率与其浓度极相关。由此可推算出当抑菌率为50% 时，丁香浓度为11.09mg/mL;当抑菌率为90% 时，丁香浓度为107.70mg/mL，即EC50为11.09mg/mL，EC90为107.70mg/mL (见表4)。

图1 丁香抑制菌丝体生长结果(左图为空白对照)

表3 丁香水提液对枇杷灰斑病菌丝生长的影响

表4 抑制菌丝体生长试验结果分析

2.3 抑制孢子萌发力测定

由图2 可以看出丁香水提液对灰斑病孢子萌发具有抑制作用，而且抑制作用随着丁香的浓度增大而不断增大，具体变化趋势(见表5)。通过DPS 软件模拟函数变化的趋势，得到机率(y)随丁香对数浓度(x)变化的关系式得y =0.3182 +2.7846x，其相关系数r 为0.9609 ＞0.8000，说明孢子萌发抑制率与丁香的浓度具有较强的相关性，当抑制率为50% 时，丁香浓度为48.01mg/mL;当抑制率为90% 时，丁 香 浓 度 为138.54mg/mL 即EC50为48.01mg/mL 和EC90为138.54mg/mL (见表6)。

图2 丁香抑制孢子萌发结果(从左到右丁香的浓度依次为0、20.0、40.0、60.0、80.0mg/mL)

表5 丁香水提液对枇杷灰斑病孢子萌发的影响

表6 抑制孢子萌发力测定试验结果分析

3 讨论

枇杷灰斑病严重危害枇杷的叶和果，目前主要采取喷药保护，而波尔液多、甲篆托布津和多霉灵等化学农药的使用，既污染环境又造成枇杷中农药残留，同时由于灰斑病原菌的繁殖能力极强，易产生抗药性，而且孢子随风传播后导致的大面积感染，更增加防治的困难。从本试验结果可看出灰斑病的孢子比菌丝体不容易被杀死，也印证了灰斑病防治的困难。本试验选取花椒、丁香、生姜、辣椒四种可食用香辛料植物做为试验材料，对灰斑病的生物防治办法进行积极的探索，若将其开发为植物源杀菌剂，将对人体无毒副作用，对环境无污染，对枇杷绿色储运将发挥重要作用。如何更有效提取丁香等食用香辛料植物的抑菌活性物质值得进一步的探讨。

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