纤维素酶法提取棉花根多糖的工艺优化

包淑云，吴义来，张艳华，喻丽珍

(1. 皖南医学院 药学院;2. 安徽省多糖药物工程技术研究中心，安徽 芜湖 241002)

棉花根又名土黄芪，性温味甘，具有补中益气、止咳平喘功效，主要用于中气下陷、脾气虚弱、气虚咳喘，民间常用其治疗咳嗽、哮喘、慢性支气管炎，［1，2］其为锦葵科草棉Gossypium herbaceum L.、树棉G.arboreum L. 及陆地棉G.hirsutum L. 等的根或根皮。据报道，棉花根可使老年小鼠红细胞和脑内丙二醛含量明显下降，超氧化物歧化酶活性增高，SOD/MDA 的比值显著升高;［3］棉花根的醇提物与水提物具有祛痰抗炎的功效。［4］对棉花根化学成分已有较多报道，主要含天冬酰胺、棉酚、树脂等，但对多糖的研究较少。［5］因多糖具有如抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血等多种生物活性，［6］鉴于纤维素酶能够有效破除细胞壁，降解纤维素，使细胞中的多糖溶解出来，提取效果较好，故探索用纤维素酶法提取棉花根多糖的工艺方法，为棉花根多糖的开发利用提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

棉花根于2008 年10 月采收于安徽省芜湖市弋江区农田，经皖南医学院生药学教研室鉴定为陆地棉Gossypium hirsutum L. 的根，洗净晾干，经粉碎得棉花根粉末;纤维素酶(活力15U/mg，上海伯奥生物科技有限公司);D－无水葡萄糖标准品(批号:110833－200904，中国食品药品检定研究所);苯酚、无水乙醇、浓硫酸、柠檬酸、柠檬酸钠均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

UV－2550 紫外可见分光光度计(日本岛津);FA2004 型电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);FW177 型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);HH 数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜电子实验仪器厂);TDL－5 低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂);SHB－3 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DZF－6050 型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);Nicolet 380 傅里叶红外光谱仪(美国热电公司)

1.3 方法

1.3.1 吸收波长的选择

准确移取一定量的棉花根多糖提取液和葡萄糖标准溶液，按硫酸－苯酚法进行显色，在波长200 ～800nm 之间进行扫描，以确定多糖的最大吸收波长。

1.3.2 葡萄糖标准曲线的制备

精密称取经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品20.0mg，蒸馏水溶解，定容至100mL，摇匀，配成200μg/mL 的葡萄糖标准溶液，备用。分别精密吸取葡萄糖标准溶液5、10、15、20、25mL 至50mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，得浓度分别为20、40、60、80、100μg/mL 葡萄糖溶液，再取上述不同浓度的葡萄糖溶液各0.5mL于具塞试管中，分别加5% 苯酚1.0mL、浓硫酸5.0mL，［7］摇匀，室温放置30min。以蒸馏水作参比，于最大吸收波长处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.3 棉花根多糖红外光谱定性分析取少量的棉花根多糖样品与适量的KBr 混合研细后压片，在4000 ～400cm－1之间进行红外光谱扫描，得棉花根多糖的红外光谱图。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 酶解温度对多糖提取率的影响

称取5 份棉花根粉末5.0g，各加入纤维素酶0.8% (质量比)，再加入pH 5.0 柠檬酸－柠檬酸钠 缓 冲 液 50mL，分 别 于 30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴锅中酶解90min，移入100℃水浴锅加热5min，以灭活纤维素酶，各加入100mL 蒸馏水，90℃浸提2h，抽滤，90℃浓缩滤液至10mL，5000r/min 速度离心30min，除去沉淀，在溶液中加入4 倍体积无水乙醇，室温静置12h，多糖沉淀析出，用95%乙醇洗涤沉淀3 次，干燥得多糖后，加蒸馏水溶解并定容至50mL，取5mL 定容至100mL 得供试提取液，取0.5mL 于具塞试管中，各加5%苯酚1.0mL、浓硫酸5.0mL，摇匀，室温放置30min。以蒸馏水为参比溶液，分别在484nm 处测定吸光度。

1.3.4.2 酶解时间对多糖提取率的影响

准确称取5 份棉花根粉末5.0g，各加入纤维素酶0.8% (质量比)，再加入pH 5.0 柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液50mL，于60℃水浴锅中分别酶解30min、60min、90min、120min 和150min，后续操作同1.3.4.1。

1.3.4.3 酶解pH 对多糖提取率的影响

准确称取6 份棉花根粉末5.0g，各加入纤维素酶0.8% (质量比)，分别加入pH 4.0、pH 4.4、pH 4.8、pH 5.2、pH 5.6 和pH 6.0 柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液50mL，于60℃水浴锅中酶解90min，后续操作同1.3.4.1。

1.3.4.4 酶添加量对多糖提取率的影响

准确称取5 份棉花根粉末5.0g，分别加入纤维素酶0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2% (质量比)，再加入pH 5.0 柠檬酸－柠檬酸钠缓冲液50mL，于60℃水浴锅中酶解90min，后续操作同1.3.4.1。

1.3.5 正交实验设计

根据棉花根多糖提取的单因素实验结果，以纤维素酶法提取的酶解温度、酶解时间、酶解PH 和酶添加量为考察因素，每个因素设3 个水平，采用L9(34)正交设计，确定纤维素酶法提取的最佳工艺参数。

1.3.6 棉花根多糖提取率的测定

准确称取5 份棉花根粉末5.0g，以最佳工艺条件进行提取，提取步骤同1.3.4.1，测得的吸光度代入线性回归方程求得C，再代入下式(式1)，即可求得棉花根多糖的提取率。

C 为样品溶液的葡萄糖重量(μg)，D 为样品溶液的稀释倍数，W 为样品重量(μg)。

2 结果与讨论

2.1 吸收波长的确定

精密吸取棉花根多糖提取液和葡萄糖标准溶液各0.5mL，分别置20mL 具塞试管中，依次加入5%苯酚溶液1.0mL、浓硫酸5.0mL，摇匀，室温放置30min 后在波长200 ～800nm 之间进行扫描，二者的最大吸收波长在484nm 处，故选择484nm作为定量测定波长，如图1 所示。

图1 吸收波长的选择

2.2 葡萄糖标准曲线

根据1.3.2 方法，以吸光度值为纵坐标，浓度值为横坐标绘制葡萄糖标准曲线，并作线性回归，得线性回归方程为y = 0.0057x + 0.0268，r =0.9994，表明在0 ～100μg/mL 范围内，其浓度与吸光度线性关系良好。

2.3 棉花根多糖的红外光谱

图2 棉花根多糖的红外光谱

由图2 可见，棉花根多糖的红外光谱呈现典型的多糖吸收特征，在3433cm－1波数出现一个吸收较强的宽峰，为羟基的伸缩振动;在2930cm－1波数峰较弱，为C－H 伸缩振动，890cm－1提示存在β－D 吡喃糖结构。

2.4 单因素试验

2.4.1 酶解温度对多糖提取率的影响

在相同条件下，分别在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃酶解，观察酶解温度对多糖提取率的影响，结果如图3 所示。

图3 酶解温度对多糖提取率的影响

从图3 可以看出，吸光度随酶解温度的升高逐渐增大，至60℃时吸光度最大，而超过60℃后，多糖提取率反而下降，推测与过高的温度引起酶部分失活有关。根据实验结果，选取55℃，60℃，65℃作为正交实验中酶解温度的3 个考察水平。

2.4.2 酶解时间对多糖提取率的影响

在相同条件下，分别酶解30min、60min、90min、120min 和150min，观察酶解时间对多糖提取率的影响，结果如图4 所示。

图4 酶解时间对多糖提取率的影响

由图4 可知，随着酶解时间的延长吸光度增大，当酶解120min 时所得提取液的吸光度趋于最大，继续延长酶解时间吸光度反而微微下降，可能是长时间的高温提取导致了部分多糖分解所致，且过长的时间也可能导致酶活性的降低。从提取率和节能两方面考虑，超出120min 的提取意义不大且能量损耗较多，故选100，120，140min 作为正交试验中提取时间的3 个考察水平。

2.4.3 酶解pH 对多糖提取率的影响

在相同条件下，分别在pH 4.0、4.4、4.8、5.2、5.6 和6.0 下酶解，观察酶解pH 对多糖提取率的影响，结果如图5 所示。

图5 酶解pH 对多糖提取率的影响

由图5 可见，随着pH 升高，吸光度缓慢增加，至pH 5.6 时吸光度最大，随后下降，故选pH 5.4，5.6，5.8 作为正交实验中酶解pH 的3 个考察水平。

2.4.4 酶添加量对多糖提取率的影响

在相同条件下，分别加入0g、0.02g (纤维素酶与棉花根的质量比为0.4%)、0.04g (质量比0.8%)、0.06g (质量比1.2%)和0.08g (质量比1.6%)的纤维素酶，观察酶添加量对多糖提取率的影响，结果如图6 所示。

由图6 可见，随着纤维素酶量的增多，吸光度缓慢增加，至酶量达到1.6%时吸光度最大，继续增加酶量，吸光度反而减小。本实验最佳酶用量为1.2 %，故选1.0 %、1.2 % 和1.4 % 作为正交实验中酶添加量的3 个考察水平。

图6 酶添加量对多糖提取率的影响

2.5 正交试验

表1 L9(34)正交试验与结果

表2 方差分析

由正交试验结果得出最优组合为A1B1C3D3，即最佳提取条件是酶解温度55℃，酶解时间为100min，酶解pH5.8，酶添加量1.4%。由表2 可知，在不考虑交互作用情况下，各因素的影响顺序为酶添加量＞酶解时间＞酶解温度＞酶解pH。

2.6 验证实验

根据1.3.6 方法，在484nm 处测定吸光度后，将吸光度代入回归方程及多糖提取率公式(式1)，得棉花根多糖的提取率为15.552‰(RSD=2.782%)。

3 结论

通过单因素和正交试验设计，对纤维素酶提取棉花根多糖的pH 环境、提取时间、提取温度和酶用量4 个因素进行考察研究，确定的优化工艺条件是:酶解pH5.8，酶解时间100min，酶解温度55℃，酶用量为1.4%。在此优化工艺条件下，棉花根多糖的提取率为15.552‰，而超声波提取法的多糖提取率为1.477%，［5］可见纤维素酶法的多糖提取率略高于超声波提取法，推测与纤维素酶有效破除细胞壁而有助于多糖的溶出有关。有关棉花根多糖提取率的进一步提高以及多糖的结构和药理作用仍需进一步研究。

［1］贾美华. 棉花子及其根皮的临床应用［J］. 上海中医药杂志，1992，26(4):31－32.

［2］马铁瑛. 棉花根治疗老年慢性支气管炎60 例［J］. 中国民间疗法，2000，8(3):31－32.

［3］欧芹，王玉民，白书阁，等. 棉花根对老年小鼠红细胞和脑内SOD 活性及MDA 含量的影响［J］. 中国老年学杂志，1994，14(2):106－107.

［4］包淑云，喻丽珍，于禧龙，等. 棉花根醇提物与水提物的止咳祛痰抗炎作用研究［J］. 天然产物研究与开发，2011，23(4):730－733.

［5］包淑云，赵志刚，陈靠山，等. 超声波提取棉花根多糖的工艺研究［J］. 时珍国医国药，2013，24(1):118－119.

［6］韩果萍，段玉峰. 我国天然活性多糖药理研究进展［J］.中药材，2003，26(2):138－141.

［7］赵启铎，舒乐新，马琳，等. 硫酸－苯酚法测定槐甘菌质多糖的含量［J］. 宜春学院学报，2011，33(8):74－76.