栀子豉汤中生物转化产物京尼平-酪氨酸衍生物制备工艺研究

齐学洁， 姚 娜， 任应宗， 崔元璐*

(1. 天津中医药大学中药学院，天津300193;2 天津市现代中药重点实验室，天津300193;3. 天津中医药大学中医药研究院，天津300193)

栀子豉汤出自张仲景的《伤寒论》，功效清热除烦，主治发汗吐下后，余热郁于胸膈，身热懊憹，虚烦不得眠，胸脘痞闷［1］。课题组根据古方中栀子先煎，豆豉后下的记载，开展了栀子豉汤中抗抑郁成分的相关研究，通过药效学实验证实京尼平-酪氨酸衍生物在较小剂量时即可显示出抗抑郁作用，提示栀子豉汤中生物转化产物京尼平-酪氨酸衍生物可能是其抗抑郁作用的有效成分［2］。

京尼平属于环烯醚萜类化合物，具有保肝利胆［3］、抗炎［4-5］、抗氧化［6］、抗血栓形成的药理作用［7］。因其细胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力强等特点作为新型交联剂被广泛应用于生物材料中［8-9］。淡豆豉是大豆的发酵产品，其中存在大量的β-葡萄糖糖苷酶和以酪氨酸为主的丰富氨基酸［10］。有文献报道，京尼平可以与含氨基基团的化合物发生交联反应形成京尼平-氨基酸衍生物［11-13］。因此本研究以京尼平和酪氨酸为反应原料，以单因素试验为基础，采用正交设计方法对栀子豉汤中的生物转化产物京尼平-酪氨酸衍生物的制备工艺进行研究，为栀子豉汤的抗抑郁研究提供实验依据。

1 仪器与材料

WH210 磁力搅拌器(德国Wiggenhauser 集团公司);FA1004 分析天平(上海天平仪器厂);DU-800 核酸蛋白分析仪(美国贝克曼公司);Perkin-Elmer spectrum10 红外光谱仪(美国铂金埃尔默公司);Jade 差示扫描量热分析仪(美国Perkin Elemer 公司);Rigaku D/max-2500X 射线衍射仪(日本Rigaku 公司);京尼平(98%，临川之信生物科技有限公司);酪氨酸(美国Sigma-Aldrich 公司);磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、醋酸(天津北方天医化学试剂厂);实验用水均为MilliQ 级纯水(由美国Millipore 公司MilliQ纯水机制备制备)。

2 方法与结果

2.1 京尼平-酪氨酸衍生物制备的单因素试验

2.1.1 反应液pH 值考察 固定京尼平与酪氨酸物质的量比为1.0 ∶1.0，调节缓冲溶液的pH 分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，60 ℃下恒温搅拌反应5 h，测定京尼平-酪氨酸衍生物在590 nm［2，14］下的吸光度。当反应的pH 为6.0时京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此将pH6.0 确定为京尼平与酪氨酸反应的最适pH 条件。

2.1.2 反应温度考察 固定京尼平与酪氨酸物质的量比为1.0 ∶1.0，pH=6.0，分别在40、50、60、70 和80 ℃条件下恒温搅拌反应5 h，测定反应产物在590 nm 的吸光度。当反应温度为70 ℃时京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此确定70 ℃为京尼平与酪氨酸的最适反应温度。

2.1.3 反应时间考察 固定京尼平与酪氨酸物质的量比为1.0 ∶1.0，pH=6.0，70 ℃下恒温搅拌反应4、5、6、7 和8 h，测定反应产物在590 nm 的吸光度。当反应5 h 时京尼平-酪氨酸衍生物的吸光度值最大，因此将5 h 确定为京尼平与酪氨酸的最适反应时间。

2.1.4 反应物质的量比考察 控制京尼平与酪氨酸物质的量比分别为1.0 ∶1.0、1.0 ∶1.5、1.0 ∶2.0 和1.0 ∶2.5，pH=6.0，70 ℃下恒温反应5 h，测定反应产物在590 nm的吸光度。当京尼平与酪氨酸物质的量比为1.0 ∶1.5 时反应产物的吸光度值最大，因此将1.0 ∶1.5 确定为京尼平与酪氨酸的最适反应物质的量比。

2.2 京尼平-酪氨酸衍生物制备的正交试验 以单因素试验为基础，在最佳试验条件上、下每组选择三个水平，设计四因素三水平的正交试验表，如表1 所示，按表1 的正交实验因素及水平，所得正交试验数据和方差分析结果分别见表2 和表3。

表1 正交试验因素及水平

正交试验结果如表2 所示，不同因素水平对京尼平-酪氨酸衍生物的影响强弱顺序为:A3＞A2＞A1;B3＞B2＞B1;C1＞C2＞C3;D2＞D3＞D1。结合表3 的方差分析结果，反应液pH 和物质的量比对京尼平-酪氨酸衍生物的生成有极显著性影响(P ＜0.01)，反应时间对产率有显著性影响(P ＜0.05)。所以京尼平-酪氨酸衍生物的最佳制备工艺为B3A3D2C1，即控制京尼平与酪氨酸物质的量之比为1.0 ∶2.0，pH=7.0，60 ℃恒温搅拌5 h。重复性验证试验的结果表明该制备工艺稳定、可重复，见表4。

2.3 京尼平-酪氨酸衍生物验证

2.3.1 红外光谱(FT-IR)分析 用KBr 将京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物及物理混合物分别压片，在4 000 ～400 cm-1范围内进行红外光谱测试。各物质的特征红外吸收如图1 所示，游离京尼平(a)在3 398，3 237，1 682，1 622，1 443 和1 300 cm-1处具有强吸收峰，属于京尼平的特征吸收峰。酪氨酸(b)的特征吸收峰在3 205，2 599 ～3 127 (氨基酸羧基的宽峰)，1 590，1 330，1 042和841 cm-1。京尼平-酪氨酸的物理混合物(d)的红外谱图是京尼平(a)和酪氨酸(b)特征吸收峰的叠加，而京尼平-酪氨酸衍生物(c)的各谱峰强度明显降低或消失，物质特征峰的变化说明衍生物的形成。

表2 正交试验结果L18(37)

表3 方差分析

表4 验证试验结果

2.3.2 差示扫描量热(DSC)分析 将京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物和物理混合物分别封闭置于铝盘中，调温速度为10 ℃/min，升温范围为30 ～350 ℃，分别记录各样品的差示热扫描升温曲线。由图2 可知，京尼平(a)在125.0 ℃出现一个尖锐的特征峰。酪氨酸 (b)在315.5 ℃出现一个尖锐的特征峰。京尼平与酪氨酸的物理混合物(d)在124.6 ℃和287.1 ℃两点均出现特征峰，分别是京尼平(a)和酪氨酸(b)的熔点峰。而京尼平-酪氨酸衍生物(c)在199.9 ℃出现新的特征峰，说明有新物质生成。

图1 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的红外光谱图

图2 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的DSC 图

2.3.3 X-射线粉末衍射(XRD)分析 室温，Cu-Ka 靶，扫描速度2 °/min，采样时间为1 s，扫描范围5 ° ～50 °，分别对京尼平、酪氨酸、京尼平-酪氨酸衍生物和物理混合物进行X-射线粉末衍射分析。由图3 可知，京尼平(a)和酪氨酸(b)均有多个特异性结晶峰产生，京尼平与酪氨酸物理混合物(d)的峰形为京尼平(a)和酪氨酸(b)结晶峰的叠加，而京尼平-酪氨酸衍生物(c)的衍射图谱中特征峰已明显减弱甚至消失，说明形成了新的物质。

3 讨论

本研究以京尼平和酪氨酸为反应原料，京尼平-酪氨酸衍生物在590 nm 处的吸光度作为考察指标，优化了栀子豉汤中生物转化产物京尼平-酪氨酸衍生物的制备工艺。

图3 京尼平(a)、酪氨酸(b)、京尼平-酪氨酸衍生物(c)和物理混合物(d)的X-Ray 衍射图谱

基于单因素试验，在最佳试验条件上、下每组选择三个水平，设计了四因素三水平的L9(34)正交试验表，而该设计中因没有空白列，选择极差较小的列作为误差列进行方差分析，所有因素与误差列相比均没有达到显著性，因此本研究选用L18(37)正交表设计试验。通过正交试验确定了京尼平-酪氨酸衍生物的最佳制备工艺条件为:京尼平和酪氨酸物质的量比为1.0 ∶2.0，在pH 为7.0 的条件下，60 ℃恒温水浴搅拌5 h。

京尼平-酪氨酸衍生物经冷冻干燥，使用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、差示扫描量热(DSC)分析和X-射线粉末衍射(XRD)分析方法进行了验证。结果显示，与物理混合物及反应原料相比，衍生物呈现出另外一种新的物相特征，确认京尼平-酪氨酸衍生物已经形成。

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