KLF6在非小细胞肺癌组织中表达的探讨

张成元，薛岑，杨文秀，薄莉

（1.贵阳医学院，贵州 贵阳 550004；2.贵阳医学院附属医院病理科，贵州 贵阳 550004）

原发性支气管肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球肺癌的发病率和死亡率均呈上升态势，尤其在经济发展中的国家［1］。男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性肺癌发病率和死亡率均占第二位。其中非小细胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%～85%［2］，NSCLC 的发生、发展是多因素参与、多基因变异所致的复杂过程，有研究表明既有癌基因的激活，亦有抑癌基因的缺失或失活。研究发现Kruppel样因子6（Kruppellike factor 6，KLF6）基因在大多数恶性肿瘤中存在异常表达，但其在肺癌中表达的情况至今少有报道。本研究通过免疫组化技术检测NSCLC 组织中KLF6蛋白的表达情况，分析其与NSCLC临床特征的相关性，探讨其与NSCLC发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集贵阳医学院附属医院2010年2月～2012年3月期间手术切除组织标本129例，其中NSCLC 92例为NSCLC组，正常肺组织37例为正常肺组织组，纳入标本均符合WHO 肺肿瘤组织学分类标准，并由专业病理医师再次明确诊断，其中男性87例，女性42例，年龄36～78岁，平均（57.10±10.68）岁（中位数年龄57 岁）。所有NSCLC 病例均按照2009年7月国际肺癌研究学会（IASLC）公布第7 版肺癌TNM 分期系统标准分级：Ⅰa期7例，Ⅰb期13例，Ⅱa期18例，Ⅱb期15例，Ⅲa期14例，Ⅲb期12例，Ⅳ期13例。所有患者均未接受过放、化疗和生物学治疗等干预措施。

1.2 试剂 浓缩型兔抗人KLF6多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，DAB 显色试剂盒、通用型二步法检测试剂盒购自美国DAKO 公司（试剂盒K5007），其它辅助用液及材料均由贵阳医学院附属医院病理科专业技术人员配制。

1.3 用免疫组织化学方法检测KLF6蛋白 采用通用型二步法（Envision 法），脱蜡，梯度酒精水化，pH 9.0修复液，高压修复，滴加一抗浓缩型兔抗人KLF6多克隆抗体，按照预实验工作浓度1∶150；4℃冰箱过夜，PBS 冲洗、TBS 冲洗，滴加二抗，37 ℃孵化25 min，DAB显色，苏木精对比染色，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，晾干后观察。操作步骤严格按照说明书进行，各步骤注意控制时间及温度，各组均以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性组织（睾丸组织）作阳性对照。

1.4 染色结果判定标准 KLF6以细胞质和细胞核染色黄色或棕褐色为阳性细胞标准（见图1）。以染色强度计分：0分为无色，1分为浅黄色，2分棕黄色，3分为棕褐色；在高倍镜下取10个不同视野，按阳性细胞所占的百分比计分：0 分为阴性，1 分为阳性细胞≤10%，2分为11%～50%，3分为51%～75%，4 分为＞75%，染色强度与阳性细胞百分比的乘积≥3分为免疫反应阳性，总体评分：≤2分者判定为阴性，3～6分者为弱阳性，＞6分者为强阳性。

1.5 统计学方法 实验学数据采用SPSS 17.0统计分析软件进行分析，计数资料用百分率表示，计数资料的组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

图1 KLF6蛋白分别在不同肺组织中的表达，Envision法，×200

2 结果

2.1 KLF6 蛋白在NSCLC、正常肺组织中表达情况 KLF6蛋白在NSCLC 中阳性率明显高于正常肺组织（P ＜0.01），见表1。

表1 KLF6蛋白在NSCLC及正常肺组织中表达 （n，%）

2.2 KLF6蛋白在NSCLC的表达与临床病理因素的关系 结果显示，KLF6蛋白在不同的性别、年龄、病理类型、临床分期的NSCLC 中表达比较差异无统计学意义（P ＞0.05），但其表达在肿瘤不同的分化程度、淋巴结转移与否组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），肺癌组织的分化程度越低，KLF6 蛋白表达率越高，有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者，见表2。

表2 NSCLC中KLF6蛋白的表达与临床病理参数的关系 （n，%）

3 讨论

KLF6又称锌指转录因子9（zine finger factor 9，ZP9），是一种普遍表达的核转录调控因子。它是一种抑制细胞生长、促进凋亡、参与细胞衰老调控的抑癌基因［3］。许多KLF家族的成员被证明与肿瘤的发生、发展有关，如在结肠癌中存在KLF4的下调，在乳腺癌中存在KLF5和KLF10的下调［4］。近年来相关研究表明，KLF6基因在肺癌、前列腺癌、结肠癌及胶质瘤中有不同程度的突变和缺失，在肿瘤组织中KLF6的表达水平降低与基因杂合性缺失有关。有研究表明，KLF6基因有抑制细胞生长的作用，它可能是一种具有广泛抑制肿瘤发生与发展作用的基因。Narla G等［5］在前列腺癌中发现KLF6可通过不依赖p53的方式直接激活p21CIP1／WAF1基因启动子来抑制细胞生长。而在肝癌和结肠癌细胞中，KLF6 通过抑制细胞周期蛋白D（cyclin D）1／细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）4 的激活影响Rh 通路，同样导致肿瘤细胞生长被抑制［6］。

在肺癌研究中，KLF6 被报道可通过激活下游基因DAPK2来诱导肺癌细胞凋亡。KLF6的抑癌作用与一系列相关的肿瘤通路有关，野生型KLF6 能以p53非依赖方式上调p21WAF1／CIP1蛋白的表达而抑制细胞增殖，通过非p53依赖途径上调p21WAF1／GIP1，通过阻止Rb基因的磷酸化而调节转录因子E2F 的活性，将细胞周期阻滞在G1／S期，抑制细胞增殖［7－9］。但肿瘤来源的KLF6变异体则失去了此功能，从而导致肿瘤发生的风险增加。本实验研究发现转录因子KLF6蛋白在NSCLC中表达率为85.87%，与正常肺组织比较差异有统计学意义（P ＜0.05），表明KLF6基因参与了NSCLC的发生、发展过程。KLF6基因在NSCLC组织中的高表达可能是在NSCLC 发病初期出现了机体的 代 偿 作 用，这 与Cho 等［10］、冯 洁 等［11］、朱 海 龙等［12］分别在结肠癌、肝细胞癌中检测到KLF6蛋白表达的报道一致。这种高表达可能是KLF6在肿瘤形成过程中被激活而发生的代偿作用，也可能是基因突变导致抑癌基因KLF6上调p21的功能下降，从而使抑制肿瘤生长的能力降低，导致在正常肺组织中无表达或低表达。

本研究显示，NSCLC 中KLF6 蛋白表达与年龄、性别、临床分期、病理类型等因素的关联性很小，差异无统计学意义（P ＞0.05）；肺癌组织的分化程度越低，KLF6蛋白表达率越高，且有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者，这为判断预后、指导治疗提供了参考依据。

综上所述，本实验从抑癌基因KLF6的蛋白表达角度进行研究，认为KLF6蛋白的高表达对肿瘤的生物学行为有着重要的作用，KLF6 参与了NSCLC 发生、发展的过程，为我们进一步研究NSCLC 发生机制及治疗新路径提供了方向，奠定了一定基础。

［1］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA：a cancer journal for clinicians，2011，61（2）：69－90.

［2］ Wakelee H，Kernstine K，Vokes E，et al.Cooperative Group Research Efforts in Lung Cancer 2008：Focus on Advanced－Stage Non–Small－Cell Lung Cancer［J］.Clinical lung cancer，2008，9（6）：346－351.

［3］ Koivisto PA，Hyytinen ER，Matikainen M，et al.Kruppel－like factor 6germ－line mutations are infrequent in Finnish hereditary prostate cancer［J］.The Journal of urology，2004，172（2）：506－507.

［4］ Ito G，Uchiyama M，Kondo M，et al.Krüppel－like factor 6is frequently down－regulated and induces apoptosis in non－small cell lung cancer cells［J］.Cancer research，2004，64（11）：3838－3843.

［5］ Narla G，Ileath KE，Reeves HL，et al.KLF6，a candidate tumor suppressor gene mutated in prostate cancer［J］.Science，2001，294（5551）：2563－2566.

［6］ Benzeno S，Narla G，Allina J，et al.Cyclin－dependent kinase inhibition by the KLF6tumor suppressor protein through interaction with cyclin D1［J］.Cancer research，2004，64（11）：3885－3891.

［7］ Sangodkar J，Shi J，DiFeo A，et al.Functional role of the KLF6tumour suppressor gene in gastric cancer［J］.European Journal of Cancer，2009，45（4）：666－676.

［8］ DiFeo A，Martignetti JA，Narla G.The role of KLF6and its splice variants in cancer therapy［J］.Drug Resist Updat，2009，12（1－2）：1－7.

［9］ Agell L，Hernández S，de Muga S，et al.KLF6and Tp53mutations are a rare event in prostate cancer：distinguishing between Taq polymerase artifacts and true mutations［J］.Modern Pathology，2008，21（12）：1470－1478.

［10］ Cho YG，Choi BJ，Song JW，et al.Aberrant expression of kruppel－like factor 6protein in colorectal cancers［J］.World Journal of Gastroenterology，2006，12（14）：2250－2253.

［11］ 冯洁，汤正好，臧国庆，等.KLF6、Sp1蛋白在肝癌、肝硬化组织中的表达及意义［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2008，17（2）：148－151.

［12］ 朱海龙，袁卫平，岳惠芬，等.KLF6蛋白在肝细胞癌组织中的表达及其意义［J］.重庆医学，2013，42（1）：33－36.