骨髓单个核细胞热休克蛋白27表达在多发性骨髓瘤中的临床价值*

王 清,张梅芳,郭晓丽,王良宏,宋 军,袁 斌,陈 驰,郭鹏翔，朱红倩

(1.贵州省人民医院血液科，贵阳550001；2.河北省新乐市人民医院内科 050700；3.贵阳医学院临床免疫教研室，贵阳 550004；4.贵州省肿瘤医院血液科，贵阳550000；5.贵阳中医学院免疫教研室，贵阳550001)

论著·临床研究

骨髓单个核细胞热休克蛋白27表达在多发性骨髓瘤中的临床价值*

王 清1,张梅芳2,郭晓丽1,王良宏3,宋 军1,袁 斌4,陈 驰5,郭鹏翔1，朱红倩1

(1.贵州省人民医院血液科，贵阳550001；2.河北省新乐市人民医院内科 050700；3.贵阳医学院临床免疫教研室，贵阳 550004；4.贵州省肿瘤医院血液科，贵阳550000；5.贵阳中医学院免疫教研室，贵阳550001)

目的 探讨骨髓单个核细胞热休克蛋白27(HSP27)表达与多发性骨髓瘤(MM)临床特征的关系。方法收集初治多发性骨髓瘤患者86例，复发难治患者27例，对照组为非血液系统恶性肿瘤患者,根据治疗方案的不同，MM患者分为初治组、复发难治常规化疗组及含硼替佐米化疗组。分别于化疗前、化疗后1、2、3疗程检测骨髓单个核细胞HSP27的表达率及蛋白水平。结果化疗前各组HSP27表达量及蛋白水平趋势为：复发难治组大于初治组大于对照组。初治组中Ⅲ期患者的HSP27明显高于Ⅱ期患者。含硼替佐米化疗方案可明显降低HSP27的表达及蛋白水平，含硼替佐米化疗方案抑制HSP27的表达力度明显优于常规化疗组。化疗后1个疗程HSP27的表达量小于1的患者，其死亡率、复发率明显低于HSP27表达量大于1的患者，且复发时间明显延后。结论骨髓单个核细胞HSP27的表达及蛋白水平与多发性骨髓瘤的分期、治疗应答、预后相关。

多发性骨髓瘤；热休克蛋白质类；预后；治疗应答

热休克蛋白(HSP)的作用主要体现为应激状态下的细胞保护作用(抗凋亡)[1]。然而，HSP的这种细胞保护机制亦可促进肿瘤细胞增殖、转移、耐药抵抗的发生[2]。既往研究证实在卵巢、胸部、肠道、肝、前列腺肿瘤中，HSP家族的一员——HSP27的表达与预后较差相关[3]。而在头、颈肿瘤中，HSP27的表达却与预后无相关性[4]。上述研究表明尽管HSP27与肿瘤的发生、发展、生物学特性、转归相关，但其在不同的肿瘤中的临床意义亦有不同。近年来，国外学者通过体外、动物模型实验证实HSP27与多发性骨髓瘤(MM)的耐药相关，并肯定了HSP27在MM中的过度表达[5-8]。然而，尚无大宗针对HSP27的表达与MM关系的临床研究。本研究通过对MM骨髓单个核细胞(BMMNC)-HSP27基因及蛋白表达水平的检测，初步探讨HSP27表达与MM治疗、缓解率、预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2010年8月至2013年12月初治MM患者86例，复发难治MM患者27例，对照组为非血液系统恶性肿瘤患者(缺铁性贫血42例，巨幼红细胞性贫血25例)。MM的诊断、治疗、疗效评判标准参照2008～2011修订版《中国多发性骨髓瘤治疗指南》(2012年搜集病例均采用2011修订版)。3组患者在年龄构成、性别、分类、分期等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)。其中，MM初治及复发难治组均以IgG型为主(45.35%，44.44%)，分期以Ⅲ期为主(69.53%，100%)。初治组与复发难治组的骨髓浆细胞比例分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。初治组86例患者中，46.51%的患者选择常规化疗方案，仅9.31%的患者选择含硼替佐米化疗方案。复发难治组中，48.42%的患者选择常规化疗方案，51.58%的患者选择含硼替佐米化疗方案。复发难治组选择硼替佐米者明显高于初治组。MM患者均行多部位穿刺(≥3)及骨髓活检，每例标本由3名形态室人员阅片，计数细胞大于或等于500个。

表1 各组BMMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平

1.2 方法

1.2.1 骨髓单个核细胞HSP27的相对表达率测定 化疗前采集患者骨髓标本5 mL，采用密度梯度离心法获取BMMNC，采用QRT-PCR对BMMNC-HSP27的mRNA表达水平进行检测。BMMNC的HSP27引物合成、相对表达率测定参照既往文献进行[9]。应用7500 Sequence Detection Software分析(Applied Biosystems，Carlsbad,California,USA)。用2-△△CT法做相对定量(每样本重复3次)。

1.2.2 BMMNC HSP27水平的ELISA测定 将上述步骤获取的BMMNC标本，使用上海西塘生物科技有限公司提供的人HSP27 ELISA试剂盒，按试剂说明书进行操作，对BMMNC的HSP27水平进行测定。

1.2.3 分组 鉴于本研究为回顾性分析，因此，分组比较包括：(1)初治、复发难治、对照组不同骨髓浆细胞亚组间的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表达水平；(2)初治、复发难治组间不同免疫分型亚组的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表达水平；(3)初治、复发难治常规化疗、含硼替佐米化疗组的BMMNC-HSP27在不同时间点的蛋白及mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 骨髓瘤患者与对照组BMMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平 初治、复发难治组不同骨髓浆细胞比例亚组间的HSP27 mRNA表达及蛋白水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)，提示骨髓浆细胞比例的不同对BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白水平表达无影响。此外，在不同的骨髓浆细胞比例分组中均可观察到：初治组、复发难治组的BMMNC-HSP27 mRNA表达水平均明显高于对照组，组内多重比较表明复发难治组的BMMNC-HSP27相对表达率明显高于初治组。相同的趋势亦见于BMMNC-HSP27蛋白水平。ELISA检验结果表明：BNNMC-HSP27的蛋白水平，初治组明显高于对照组，而复发难治组则高于初治组，见表1。

2.2 MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平在MM不同分型中的变化 初治、复发难治组的BMMNC-HSP27的mRNA表达在不同的分型中比较差异均无统计学意义(P>0.05)。初治、复发难治组的BNNMC-HSP27的蛋白水平在不同的骨髓瘤分型中比较差异均无统计学意义(P=0.609)。见表2。

表2 MM患者MMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平在MM不同分型中的变化

2.3 初治组患者BMMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平在MM不同分期中的变化 Ⅲ期MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表达明显高于Ⅱ期患者，二者比较差异有统计学意义(P=0.004)。Ⅲ期患者BNNMC-HSP27的蛋白水平明显高于Ⅱ期患者，二者比较差异有统计学意义(P=0.009)。见表3。

表3 初治组患者MMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平在MM不同分期中的变化

2.4 MMNC-HSP27的mRNA表达、蛋白水平与治疗应答的相关性 由图1可知：分组、时间因素对BMMNC-HSP27相对表达率的影响具有显著性(交互效应、分组、时间主效应P<0.05)。固定时间因素可知：治疗前、治疗后1个疗程HSP27的相对表达量从高到低均为复发难治硼替佐米化疗组、复发难治常规化疗组、初治硼替佐米化疗组及初治常规化疗组；治疗后2疗程，复发难治常规化疗组的BNNMC-HSP27表达最高(1.70±0.49)，其余3组虽低于复发难治常规化疗组，但组间比较差异无统计学意义(1.02±0.48,0.86±0.48,0.54±0.58)。相同的趋势亦可于治疗后3个疗程观察到。固定分组因素：初治常规化疗组的BMMNC-HSP27相对表达率在1～2个化疗周期内呈进行性降低，但化疗后2～3个疗程间相比HSP27的表达差异无统计学意义(P>0.05)；复发难治常规化疗组治疗后1个疗程BMMNC-HSP27的表达无明显变化，于治疗后2～3个疗程虽稍降低，但降低幅度明显低于其余3组。初治硼替佐米化疗组中，治疗后1个疗程，HSP27的表达明显降低，其后，随疗程推移而保持相对稳定的状态；复发难治硼替佐米化疗组中，HSP27与化疗后1～2个疗程出现进行性降低，但于化疗后2～3个疗程保持相对稳定状态。BNNMC-HSP27的蛋白水平的变化趋势与mRNA变化大致相同。

*：P<0.05，**：P<0.01，与初治常规化疗组(治疗前)比较；#：P<0.05，##：P<0.01，组内两两比较。不同的条图模型代表不同的治疗状态(时间点)。误差棒代表标准差。

图1 BMMNC-HSP27 mRNA表达及蛋白水平在不同分组、不同时间点的变化趋势

2.5 MMNC-HSP27的mRNA表达、蛋白水平与预后的相关性 113例患者中，17例失随访，随访率为84.96%。随访病例中，放弃治疗11例，转外地治疗4例，2例死于严重感染。剩余96例患者中，40例化疗后1个疗程时，BMMNC-HSP27相对表达率小于1,56例BMMNC-HSP27相对表达率大于1。此96例患者随访时间为6～24个月，中位随访时间为15个月。随访观察至2014年3月1日结束。BMMNC-HSP27相对表达率大于1组中有10例患者死亡，病死率为17.85%；BMMNC-HSP27相对表达率小于1组中，2例患者死亡，病死率为5.00%，后者的病死率明显低于前者(P<0.05)。BMMNC-HSP27相对表达率大于1组中有23例患者复发，复发率为46.00%，复发时间为化疗后(94±20)d；BMMNC-HSP27相对表达率小于1组中有8例患者复发，复发率为20.00%，复发时间为化疗后(155±23)d，后者的复发率明显低于前者(P<0.05)，且复发时间明显高于前者(P<0.05)。

3 讨 论

HSP27存在于所有活体细胞表面，其细胞保护作用可阻止应激状态细胞所致的细胞凋亡[10-12]。然而，一系列的既往研究证实HSP27的过度表达往往在肿瘤的增殖、转移中起促进作用[13]。诸多文献虽证实HSP27的过度表达往往与MM的耐药相关，且阻滞HSP的表达后，MM的耐药突变可被逆转[14]，但尚无动物及临床试验报道。其原因可能为：(1)恶性浆细胞的非均一分布所致的样本浆细胞比例相差较大，且骨髓单个核细胞中浆细胞比例极低；(2)对于治疗有效的病例，骨髓中浆细胞逐渐下降甚至消失，在此背景下，鉴于分组、时间点不同，所得单个核细胞中的成分区别巨大，如仍按照体外研究的模式将研究对象界定于MM细胞，即使使用流式细胞仪等技术对标本进行纯化，亦无法保证不同人群及不同时间点的骨髓瘤细胞HSP27表达一定具有可比性。

与体外研究不同，本研究选用BMMNC作为研究对象以评估HSP表达与MM临床特征、疗效、预后的相关性。研究证实骨髓浆细胞比例并不影响BMMNC-HSP27的mRNA表达及蛋白水平，在不同骨髓浆细胞比例组中，初治组及复发难治组的mRNA表达及蛋白水平均存在差异，该结果表明MM细胞水平的变化并不足以影响总体BMMNC-HSP的表达及蛋白水平。进一步的分析表明BMMNC-HSP27的表达与分型无关，而与分期相关。此外，对BMMNC-HSP27表达量及蛋白水平的持续监测证实含硼替佐米的化疗方案可明显降低HSP27的表达及蛋白水平，且抑制BMMNC-HSP27的表达力度明显优于常规化疗组。治疗状态的比较证实初治患者中，BMMNC-HSP27表达及蛋白水平明显降低，且可一直维持相对较低状态。而复发难治的常规化疗患者，BMMNC-HSP27表达无明显改变。即使加用硼替佐米后，BMMNC-HSP27的表达量及蛋白水平略微下降，但仍低于初治硼替佐米化疗组的患者下降幅度。该结果表明化疗后BMMNC的HSP27表达量及蛋白水平可用于监测治疗应答。而对预后的判定则证实BMMNC-HSP27与复发率、复发时间、死亡率相关。本研究结果表明化疗后1个疗程BMMNC-HSP27的表达量小于1的患者，其病死率、复发率明显低于BMMNC-HSP27表达量大于1的患者，且复发时间明显延后。

本研究的意义在于证实BMMNC-HSP27的表达对于MM的诊疗及预后评估有一定的监测意义。将HSP27作为治疗靶点或可改善MM的疗效，并对新药物、新化疗方案的设定、论证起一定的辅助证明作用。本研究中，含硼替佐米的化疗方案无论对于初治、还是复发难治的患者均可明显降低HSP27的表达及蛋白水平，提示硼替佐米或可通过下调HSP27的表达，促进MM细胞的凋亡。

[1]Acunzo J,Katsogiannou M,Rocchi P.Small heat shock proteins HSP27(HspB1),αB-crystallin(HspB5) and HSP22(HspB8) as regulators of cell death[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(10):1622-1631.

[2]Mcconnell JR,Mcalpine SR.Heat shock proteins 27,40,and 70 as combinational and dual therapeutic cancer targets[J].Bioorg Med Chem Lett,2013,23(7):1923-1928.

[3]Zoubeidi A,Gleave M.Small heat shock proteins in cancer therapy and prognosis[J].Intern J Biochem Cell Biol,2012,44(10):1646-1656.

[4]Khalil AA,Kabapy NF,Deraz SF,et al.Heat shock proteins in oncology:Diagnostic biomarkers or therapeutic targets?[J].BBA-Reviews on Cancer,2011,1816(2):89-104.

[5]Yasui H,Hideshima T,Ikeda H,et al.BIRB 796 enhances cytotoxicity triggered by bortezomib,heat shock protein(Hsp) 90 inhibitor,and dexamethasone via inhibition of p38 mitogen-activated protein kinase/Hsp27 pathway in multiple myeloma cell lines and inhibits paracrine tumour growth[J].Br J Haematol,2007,136(3):414-423.

[6]Navas TA,Nguyen AN,Hideshima T,et al.Inhibition of p38alpha MAPK enhances proteasome inhibitor-induced apoptosis of myeloma cells by modulating Hsp27,Bcl-X(L),Mcl-1 and p53 levels in vitro and inhibits tumor growth in vivo[J].Leukemia,2006,20(6):1017-1027.

[7]Chauhan D,Li G,Auclair D,et al.2-Methoxyestardiol and bortezomib/proteasome-inhibitor overcome dexamethasone-resistance in multiple myeloma cells by modulating Heat Shock Protein-27[J].Apoptosis,2004,9(2):149-155.

[8]Chauhan D,Li G,Shringarpure R,et al.Blockade of Hsp27 overcomes Bortezomib/proteasome inhibitor PS-341 resistance in lymphoma cells[J].Cancer Res,2003,63(19):6174-6177.

[9]Tsai JR,Liu PL,Chen YH,et al.Ginkgo biloba extract decreases non-small cell lung cancer cell migration by downregulating metastasis-associated factor heat-shock protein 27[J].PLoS One,2014,9(3):e91331.

[10]Katsogiannou M,Andrieu C,Rocchi P.Heat shock protein 27 phosphorylation state is associated with cancer progression[J].Front Genet,2014,5:346.

[11]Zhang L,Fok JH,Davies FE.Heat shock proteins in multiple myeloma[J].Oncotarget,2014,5(5):1132-1148.

[12]Vidyasagar A,Wilson NA,Djamali A.Heat shock protein 27 (HSP27):biomarker of disease and therapeutic target[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2012,5(1):7.

[13]Jego G,Hazoumé A,Seigneuric R,et al.Targeting heat shock proteins in cancer[J].Cancer Lett,2013,332(2):275-285.

[14]Chauhan D,Li G,Hideshima T,et al.Hsp27 inhibits release of mitochondrial protein Smac in multiple myeloma cells and confers dexamethasone resistance[J].Blood,2003,102(9):3379-3386.

The clinical value of HSP27 expression of bone marrow mononuclear cells in multiple myeloma*

WangQing1,ZhangMeifang2,GuoXiaoli1,WangLianghong3,SongJun1,YuanBin4,ChenChi5,GuoPengxiang1，ZhuHongqian1

(1.DepartmentofHematology,thePeople′sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550001,China；2.DepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofXinleCity,XinLe,Hebei050700，China；3.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004，China；4.DepartmentofHematology,CancerHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550000，China；5.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine，Guiyang,Guizhou550001，China)

Objective To investigate the relationship of HSP27 expression with treatment response,remission rate,prognosis in multiple myeloma(MM) patients.MethodsEighty-six patients with MM first diagnosis and 27 relapse cases were collected respectively.Control was defined as non-hematological malignance.The MM patients divided into first diagnosis,relapse conventional chemotherapy group and bortezomib group.HSP27 expression and protein level were measured on pre-and post 1,2 and 3 treatment circles.ResultsThe tendency of HSP expression and protein level:relapse-MM patients>first-diagnosis MM patients>control.HSP27 expression and level in Ⅲ phase was higher than those in Ⅱ phase for first-diagnosis MM patients.Bortizomib-containing chemotherapy protocol showed more effectively decrease on HSP27 than chemotherapy treatment only.At post-1 treatment circle,HSP27<1 showed higher survival rate than HSP27>1 and delayed the relapse time.ConclusionBMMNC-HSP27 expression and protein level is associated with staging,treatment response and prognosis in MM patients.

multiple myeloma;heat-shock proteins;prognosis;treatment response

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.015

贵州省联合基金资助项目(黔科合SY[2010]3127号)。

：王清(1972-)，副主任医师，博士，主要从事血液系统恶性肿瘤研究。

R559

A

1671-8348(2015)35-4946-04

2015-06-20

2015-08-18)