近红外漫反射技术测定烤烟烟叶中的茄尼醇

付秋娟，杜咏梅*，张怀宝，侯小东，李燕华，李丹丹

1中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101;2 山东京鲁烟叶复烤有限公司，潍坊 262200

茄尼醇(Solanesol)是重要的生物活性物质中间体，是泛醌类药物中间体不可替代的成分，即辅酶Q10 和维生素K 的侧链，在治疗心血管系统疾病［1］、癌症［2］和肝病［3］等方面有独特的疗效。烟草是茄尼醇含量最高的植物，也是目前提取茄尼醇的主要原料。茄尼醇分子量大，沸点高，液相色谱法是目前烟草茄尼醇检测最主要的方法。由于茄尼醇在烟草体内以游离态和化合态(主要以乙酸酯、棕榈酸酯、亚油酸酯)两种形式存在，烟草总茄尼醇的提取需经过复杂的皂化、萃取过程［4-10］，方法繁琐，步骤复杂，测定周期长，检测效率低，不利于批量操作，且消耗大量有机溶剂，因此建立一种高效的总茄尼醇(下述中的茄尼醇均指总茄尼醇)检测方法，对于烟草茄尼醇资源的快速筛选具有重要意义。

近红外光谱具有分析速度快、样品前处理简单、低消耗、多组分同时测定和适合在线检测等诸多优点，成为近年来发展最快、引人注目的一门独立的分析技术。本研究首次利用近红外漫反射光谱技术建立了烤烟烟叶中总茄尼醇的定量分析模型，对烟叶中的茄尼醇进行快速准确的测定。

1 材料和方法

1.1 材料、仪器

2010～2011年，在我国主要烤烟生产省份(云南、贵州、四川、重庆、湖南、湖北、福建、广西、山东、河南、黑龙江、辽宁、吉林、陕西)，分别选取1～6 个代表产地，每产地选取一套等级(B2F、C3F、C3L、X2F)代表样品，共选取样品243 份。用其中80%(193 个)的样品作为建模样品集(校正集)，20%(50 个)作为验证样品集(验证集)和转移样品(表1)。

Aataris II FT-NIR 光谱仪(Thermo Fisher 公司)，配有积分球漫反射采样系统，Result 操作软件，TQ Analyst 8.0 分析软件;超高效液相色谱仪(Waters，H-Class)，KQ-500GVDV 型恒温超声器(上海昆山)，Sartorius 电子天平(精度0.0001 g)，立鹤牌302 型烘箱(山东潍坊)，SY-Ⅲ型实验用切丝机(河南富邦实业有限公司)。

表1 校正集和验证集茄尼醇含量分布Table 1 Content distribution of solanesol in calibration and validation set

1.2 研究方法

1.2.1 样品制备

由外观鉴定专家根据GB2623-92《烤烟》对选择样品进行等级平衡、鉴定及品质评价后，选取代表等级烟叶3～5 kg，去筋，切丝(0.9±0.1 mm)，混匀，取100 g 烟丝放入烘箱内，60 ℃烘干后制成粉末(60目)，进行近红外光谱采集。

1.2.2 茄尼醇化学值的测定

称取烟草粉末样品0.1 g(精确至0.0001 g)，放入20 mL 带有聚四氟乙烯密封盖的离心玻璃管中，用移液管加入1.0 mL 的氢氧化钠乙醇(0.1 moL/L)溶液及5.000 mL 正己烷溶液，盖上密封盖，振荡，混匀，放入恒温超声提取器中，在超声频率45 KHz，温度40 ℃条件下，提取30 min，取出，冷却至室温，旋开密封盖，加入8 mL 去离子水，盖紧瓶盖，充分振荡后，放入离心机，3000 rpm，离心10 min 取出，用移液枪移取0.500 mL 离心管中上层正己烷茄尼醇提取液，流动相稀释至5.000 mL，用0.22 μm有机滤膜过滤至液相色谱安培瓶中，应用超高效液相色谱(UPLC)进行检测。

色谱条件:色谱柱:BEH C18(1.7 μm，2.1 ×100 mm)，流动相:甲醇∶乙腈=50 ∶50，流速:0.5 mL/min，柱温:35 ℃，检测波长:210 nm。茄尼醇液相色谱图见图1。

该方法为本实验室开发(ZL201310282917.0)，试验的加标回收率范围为93.4%～102.3%，RSD范围为1.61%～2.43%，方法精密度RSD 为2.49%，回收率和精密度较高，符合定量分析要求。

图1 茄尼醇液相色谱图Fig.1 UPLC chromatograms of solanesol

1.2.3 近红外光谱采集

取烟叶样品粉末20 g 置石英测量杯中，加上压样器，放在旋转台内进行光谱采集。采集条件:以仪器内置背景为参比，波数范围:10000～3800 cm-1，扫描次数:64 次，分辨率:8 cm-1。实验室温度控制在20～24 ℃。

1.2.4 定量校正模型的建立

应用TQ Analyst 8.0 分析软件中的偏最小二乘(PLS)回归算法，把采集的近红外漫反射光谱数据与化学方法测定的茄尼醇的化学值，采用留一(leave-one-out)交叉验证法建立校正模型，并进一步优化验证，以校正模型的相关系数(R)、校正均方差(RMSEC)、交叉验证均方差(RMSECV)、预测均方差(RMSEP)等指标来考察模型的建模效果，所有参数的计算方法见文献［11，12］。通常相关系数越接近100%，均方差越小，表示模型的预测值越接近化学值，拟合效果越好。模型建立以后，用外部验证来检验模型的预测能力。

1.2.5 模型传递

分别采用无标转移和有标转移两种方法进行模型传递，无标转移是将模型直接传递到其他仪器上;有标转移是先将转移样品的一部分添加在待转移仪器模型上，重新计算模型，得到一个新模型，然后用其他转移样品考察新模型的预测效果。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方法对校正模型的影响

近红外光谱在采集过程中，为了消除样品的颗粒大小、装样条件、仪器条件等影响而产生的光谱基线漂移和偏移及信噪比降低等问题，通常采用平滑和求导的方法进行数学预处理［13］。表2 为分别采用原始光谱、一阶导数和二阶导数光谱建立模型时的相关系数(R)、交叉验证均方差(RMSECV)、预测均方差(RMSEP)。结果表明，茄尼醇模型采用一阶导数，Savitzky Golay 平滑建模时，得到了较低的交叉验证均方差(RMSECV)。二阶导数虽然取得了较高的相关系数，但交叉验证过程中均方差(RMSECV)和预测均方差(RMSEP)均较高，结合主因子数考察发现模型有“过拟合”现象。因此光谱预处理选择一阶导数，Savitzky Golay 平滑建立了茄尼醇的定量校正模型。

表2 不同预处理方法对校正模型RMSECV 的影响Table 2 Effect of different pretreatment methods on the correction model of RMSECV

2.2 谱区范围选择对校正模型的影响

表3 为使用不同谱区的光谱信息建立校正模型时的相关系数R 和均方差RMSECV 值，其中谱区10000～4000 cm-1为全谱区，括号内数字为PLS 主因子阶数。从表3 数据可以看出，谱区范围的选择对定量分析精度影响较大。茄尼醇模型采取一阶导数预处理并用不同谱区范围建立的模型中，以7836.02～3893.62 cm-1建立校正模型的均方差RMSECV(0.121)最小，因此选择7836.02～3893.62 cm-1谱区作为茄尼醇模型的最佳建模谱区。

表3 不同谱区范围对RMSECV 的影响Table 3 Effect of different spectral range on RMSECV

2.3 模型的优化与外部验证

基于前述得到的建模参数，即建立了茄尼醇的定量分析校正模型。然后对模型进一步优化，通过判断和剔除异常样品(Outlier)和强影响点［14］，确定最优主因子，获得了茄尼醇的最佳校正模型，模型交叉验证均方差RMSECV 为0.108。优化后模型的各项参数见表4，NIR 预测值与化学值的散点图见图2。

表4 茄尼醇校正模型的数理指标Table 4 Statistics results for calibration models

图2 茄尼醇的化学值与模型预测值的散点图Fig.2 Scatter plot of NIR predicted and chemical value

为了检验模型的预测能力，通常选用一批未参与建模的样品对模型进行外部验证，本文用前述的50 个验证集样品对模型进行预测，通过预测值和化学值的内部交叉验证均方差(RMSECV)和预测均方差(RMSEP)检验模型的预测能力。从茄尼醇预测模型的预测值和化学值散点图和相关图(图2、图3)看出，NIR 预测值能够很好的逼近标准值，达到较低的预测均方差和相对偏差，其RMSEP 为0.0822，化学值和NIR 预测值的平均相对偏差为5.3%。利用DPS v7.05 统计分析软件，通过配对t 检验进一步验证发现，P 值(双尾)为0.831，大于0.05，说明化学方法和近红外速测两种方法不存在显著差异，即没有系统误差，模型具有很好的预测能力。

图3 模型预测值和化学值的相关图Fig.3 Correlogram between model predicted values and chemical values

2.4 模型传递

50 个转移样品分别用无标转移(即直接转移)和有标转移法将模型转移到另一台近红外仪器(从仪器)上，“从仪器”与“主仪器”型号相同，均为Aataris II FT-NIR 光谱仪(Thermo Fisher 公司)。无标转移和有标转移模型效果图见图4，从图4 看出无标转移法中“从仪器”光谱产生了较大的系统偏差，转移样品产生较大偏离，造成模型的预测均方差较大，无标转移效果不是很理想，因此考虑采用有标转移法。将50 个转移样品中的10 个添加到“从仪器”的模型里，重新计算模型，得到了“从仪器”的模型，转移模型的相关系数及预测均方差见表5，由表5 和图4 可知，虽然两种转移方法“主仪器”和“从仪器”模型的各项参数接近，但有标转移模型的预测均方差RMSEP(0.114)更低，转移效果更佳，模型成功地转移到“从仪器”上。

图4 模型转移效果图Fig.4 Model transfer renderings

表5 转移模型无标转移和有标转移的各项参数Table 5 Parameters of calibration transfer without standard sample and calibration transfer with standard sample

3 结论

选取具有代表性的建模样品，采用一阶导数预处理光谱，选择7836.02～3893.62 cm-1谱区建立了较高准确性的茄尼醇近红外预测模型，模型内部交叉验证均方差(RMSECV)为0.108，外部验证的预测均方差(RMSEP)为0.0822，平均相对偏差为5.3%，结果表明近红外预测值与化学值结果较为一致。并通过有标转移法成功地将模型转移到其它仪器上，实现了不同实验室对批量样品的快速检测，同时也为筛选高含量茄尼醇品种提供了快速有效的方法。

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