沼液中化学成分的研究

吴慧斌，刘丁才，许剑锋

上海海洋大学食品学院，上海 201306

沼液是人畜粪便和各种农作物秸秆等有机物经沼气池密封厌氧发酵产生沼气后的液体残留物［1］，是沼气工程产生的两大副产物之一，主要被用作叶面肥、饲料添加剂、浸泡种子等。目前研究表明，沼液是一种速效水肥，含有多种农作物所需的营养元素［2，3］，它不仅含有作物生长所必需的氮、磷、钾、微量元素、氨基酸等多种营养物质，而且含有植物生长激素、B 族维生素、抗生素等活性、抗性物质［4］。研究发现，通过对生长作物喷洒沼液有促进作物生长和预防或抑制病虫害的作用，而且对20 多种病虫害的防治效果达到或超过了现在使用的农药效果［5］，但目前研究仅限于沼液的理化性质，矿物质含量、重金属含量以及氨基酸和B 族维生素含量的测定，对其抑菌机理和化学成分的详细研究并没有报道。而现在沼气应用已在全国范围内大范围推广，沼液的量急剧增加，所以对沼液成分的研究有利于废弃物的综合利用，不仅可以减少农药和一些化学药品的使用，降低农业成本，同时也可以减少对环境的污染，有较高的社会效益。

本研究针对以鸡粪为原料的沼液成分进行了分析鉴定，刘丁才等在前期的工作中已经从沼渣中分离到6 个化合物，β-谷甾醇、22β-羟基-β-白檀桐、29-羟基-12-土当归烯-3，22-二酮、17β-雌二醇、S(-)-雌马酚［6］。在之前研究的基础上从沼液中进一步分离出4 个化合物，经鉴定，一个为新化合物，24-降齐墩果烷-4，12-二烯-3，22-二酮(1)，3 个为已知化合物，8-羟基-3，4-二氢喹啉-2 酮(2)、(E)-3-(2-羟基苯)丙烯酰胺(3)、苯乙酸(4)。这些化合物都是从鸡粪沼液中首次分离出来。其中，研究发现苯乙酸在体内具有抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡的作用，但是有剂量依赖性［7］。

1 仪器与材料

Bruker AVANCE Ⅱ600 型核磁共振仪，TMS 为内标(Bruker);Bruker ALPHA 红外光谱仪;Waters Q-TOF 高分辨电离喷雾质谱;凝胶Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech;柱层析硅胶(200～300 目)和硅胶薄层色谱预制板(GF254)购自青岛海洋化工有限公司;制备HPLC 色谱柱填料(Sino Chrom ODS-BP 10 μm，20 mm ×250 mm;色谱处理系统:EC2000 GPC 系统)购自大连依利特分析仪器有限公司;液相色谱级甲醇、乙腈购自Sigma 公司;水为娃哈哈纯净水;其余试剂均为分析纯(AR)，上海国药集团化学试剂公司;沼液取自于上海市浦东新区六灶镇文彬养鸡场沼气池，经同济大学现代农业科学与工程研究院朱洪光教授鉴定为以鸡粪为原料产生的沼液，标本现存于上海海洋大学食品学院海洋与生物制药研究室。

2 提取与分离

鸡场沼液在室温下50 ℃减压浓缩去掉80%水分得到沼液浓缩液，将沼液浓缩液与萃取溶剂按1∶2 进行萃取。先用石油醚进行萃取，合并浓缩后得石油醚萃取物41 g;其次用乙酸乙酯进行萃取，合并浓缩后得到乙酸乙酯萃取物84 g;再次用正丁醇进行萃取，收集、浓缩得到正丁醇萃取物57 g;由于余下水相所溶物质一般都是极性很大的糖类、蛋白等，故舍弃。

沼液石油醚和乙酸乙酯萃取部分，经薄层色谱(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)展开，并用10%浓硫酸乙醇溶液染色烘干后发现有相同的显色点，因此合并两个部位。向萃取物浸膏中加入等量的粗硅胶，搅拌均匀并烘干上样，经200～300 目硅胶柱层析，依次以石油醚:乙酸乙酯(PE/EA)(100∶0→30∶1→25∶1→20∶1→15∶1→8∶1→3∶1→1∶1)梯度洗脱，洗脱液根据TLC 检测结果合并、浓缩，得到四部分(F1～F4)。F3 经200～300 目硅胶柱层析，硅胶H 柱层析，葡聚糖LH-20 柱层析，再经半制备HPLC 纯化，以88%甲醇/水溶剂等度洗脱，流速10 mL/min，收集时间tR=14.32 min 出峰的组分，得化合物1。

将沼液正丁醇部分经300～400 目硅胶柱层析，依次以氯仿/甲醇溶液(30∶1→25∶1→20∶1→15∶1→10∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脱，洗脱液根据薄层色谱(TLC)检测结果合并、浓缩，得五个部分(N1～N5)。第三部分先用少量甲醇萃取，减压浓缩，再经凝胶LH-20 层析以100%甲醇溶液进行反复等度洗脱，得到化合物2;第四部分直接用少量甲醇萃取，然后减压浓缩，再经凝胶LH-20 层析以100%甲醇溶液进行反复等度洗脱，得到化合物3 和4。

3 结构鉴定

图1 化合物1 的主要二维相关信号Fig.1 Key COSY (—)and HMBC )correlations of compound 1

表1 化合物1 的核磁共振数据Table 1 1D-and 2D NMR data of 1(CDCl3)

化合物2 白色无定型粉末，易溶于甲醇;IR(KBr)vmax:3224，1644，1587，1492，1440，1271，1197，795，739 cm-1;1H NMR (CD3OD，600 MHz)δ:6.80 (1H，t，J=7.8 Hz，H-6)，6.68 (1H，d，J=8.4 Hz，H-7)，6.65 (1H，dd，J=7.5，1.1 Hz，H-5)，4.48(1H，s，8-OH)，2.91 (2H，t，J=7.5 Hz，H-4)，2.55(2H，t，J=7.6，H-3);13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:173.3 (s，C-2)，145.3 (s，C-8)，126.3 (s，C-9)，126.0 (s，C-9)，124.2 (d，C-6)，119.6 (d，C-5)，114.4 (d，C-3)，31.6 (t，C-3)，26.2 (t，C-4)。化合物2 的13C NMR 数据与已知结构8-羟基-3，4-二氢喹啉-2 酮的文献［9］数据相比，二者一致，从而确定了化合物2 的结构。

化合物3 无色片状晶体(MeOH);IR (KBr)vmax:3445，654，1600，1556，1427，1351，1028，757 cm-1;1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.95 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，7.65 (1H，dd，J=7.8，0.8 Hz，H-6')，7.53 (1H，td，J=7.6，1.3 Hz，H-4')，7.35(1H，d，J=8.3 Hz，H-3')，7.24 (1H，td，J=7.5，0.9 Hz，H-5')，6.61 (1H，d，J=9.4 Hz，H-2)，4.86(1H，OH-1');13C NMR (CDCl3，150 MHz)δ:165.4(s，C-1)，142.7 (d，C-3)，139.8 (s，C-2')，131.9(d，C-4')，129.1 (d，C-6)，123.9 (d，C-5)，121.6(d，C-2)，121.4 (s，C-1')，116.8 (d，C-3')。推出来的结构与已知结构o-coumaric acid amide［10］的结构一致，从而确定了化合物3 就是(E)-3-(2-羟基苯)丙烯酰胺。

化合物4 无色不定型结晶(MeOH)，易溶于甲醇和乙醇，有刺激挥发气味。1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.26-7.31 (4H，m，H-2'，H-3'，H-5'，H-6')，7.21～7.24 (1H，m，H-4')，4.92 (1H，brs，OH)，3.58 (2H，s，H-2);13C NMR (CD3OD，150 MHz)δ:175.5 (s，C-1)，136.0 (s，C-1')，130.3 (d，C-2'，6')，129.4 (d，C-3'，C-5')，127.8 (d，C-4')，41.9(t，C-2)。化合物4 的13C NMR 与已知结构苯乙酸的文献［11］数据相比，二者完全一致，从而确定了化合物4 的结构。

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