中国结核杆菌利福平耐药株rpoB 基因531、526、516 位点碱基突变特点

曹翌明 李 丽 孟繁荣 刘志辉

利福平(rifampicin，RFP)作为目前结核病短程化疗的关键药物，其主要作用机制为与结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)RNA 聚合酶β 亚单位结合而干扰转录和RNA 延伸。MTB 对RFP 产生耐药主要因其编码RNA 聚合酶β 亚单位的rpoB 基因突变所致，这已是不争的事实，并由此开发了多种RFP耐药分子检测方法［1］。这些方法的研究及其逐步应用，为我们掌握MTB rpoB 基因突变的分子特征及它们与耐药表型之间的关系积累了丰富的资料。但是单个研究往往样本量较小，菌株代表性也不强，难能从中抽象出MTB rpoB 基因突变的总体特征。遵从当今日益推崇的循证医学理念，于2013 年开始我们即对PubMed 数据库中MTB rpoB 基因突变研究文献予以密切关注，并对中国MTB 株的研究数据进行循证分析［2-3］。在分析RFP 耐药MTB 株rpoB 基因507 -533 位利福平耐药决定区(rifampin resistance- determining region，RRDR)序列突变特征(相关数据另文发表)过程中，我们发现其531、526、516 位点的基因突变各具其特点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 文献纳入与排除标准 纳入标准:①研究对象为包括中国大陆及香港、澳门、台湾来源的RFP 耐药MTB 株;②研究菌株RFP 耐药表型明确;③基因突变位点、碱基与氨基酸变化等突变信息均有良好提供。排除标准:①重复报道文献;②二次研究文献;③中、英文以外其它语种发表的文献。

1.2 文献检索 以“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND China”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Hong Kong”、“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Macon”和“rpoB AND Mycobacterium tuberculosis AND Taiwan”检索式在Pubmed 数据库中检索，末期检索日期为2015 年3 月31 日。

1.3 文献筛选 严格按照纳入和排除标准筛选文献，2 名专业人员独立阅读所获文献的题目和摘要，在排除明显不符合纳入标准的文献后，对可能符合纳入标准的文献查阅(对Pubmed 数据库中非免费全文文献借助广东省科技图书馆原文传递系统公共平台获得)并研读全文，以确定其是否真正符合纳入标准。

1.4 数据提取 由2 名专业人员独立选择文献、提取资料并交叉核对，意见不一致时由第三位研究者决定取舍。提取的主要资料包括:第一作者姓名、研究机构、Pubmed 标识码PMID、文献发表年度、菌株来源、研究菌株总数以及突变类型、位点、碱基变化、氨基酸(AA)变化、突变株数量(N)等。

1.5 统计学分析 对纳入研究文献的基因突变计数资料信息进行合并计算。

2 结果

2.1 纳入研究的基本特征 依检索策略检出130 篇文献，通过阅读文题与摘要31 项研究明显不符合文献纳入标准;对所剩99篇文献进行全文查找、研读全文，最终49 篇文献纳入本研究(包括中文12 篇、英文37 篇)，获得3 319 株利福平耐药结核杆菌中国株rpoB 基因各位点碱基突变的详细信息。纳入文献的基本情况见表1。

表1 纳入文献的基本情况

2.2 3 319 株利福平耐药结核杆菌中国株rpoB 基因531、526、516 位点碱基突变情况在3 319 株利福平耐药结核杆菌中国株中，257 株未检测到rpoB 基因任何位点的突变，占7.74%;其余3 062株(92.26%)则在rpoB 基因的不同位点检测到多种不同类型的突变。在3 062 株rpoB 基因突变株中:531、526、516 位点突变的发生率分别为54.44%(1 667/3 062)、27.07%(829/3 062)和8.92%(273/3 062);531 位点碱基突变以TCG/TTG 突变为主，占93.58%(1 560/1 667);526 位点碱基突变主要有CAC/GAC、CAC/TAC、CAC/CGC、CAC/CTC、CAC/AAC 等类型，分别占33.53%(278/829)、26.30%(218/829)、13.27%(110/829)、10.13%(84/829)、8.08%(67/829);516 位点碱基突变主要有GAC/GGC、GAC/GTC、GAC/TAC 等类型，分别占35. 53% (97/273)、35.53%(97/273)、16.85%(46/273)。具体情况见表2。

3 讨论

对于MTB RFP 耐药的分子机制，迄今已经基本阐明，人们研究发现约95%左右的RFP 耐药菌株中存在rpoB 基因突变，且多发生在rpoB507 ～533 位27 个氨基酸密码子(81bp)组成的区域(即前述的利福平耐药决定区RRDR)内，这与我们对4149 株利福平耐药MTB 株rpoB 基因RRDR 序列的循证分析结果(93.64%)相近(相关数据另文发表)，但是有文献报道531、526、516 位点的突变率分别为39.9%、34.2%和7.5%［4］，与本文的54.44%、27.07%和8.92%有较大的差别，尤其是531 位点。这可能是此文献给出的为来自全球研究报道的综合信息，而本分析结果则是特对中国MTB 菌株而言，那么其中又蕴藏着一些令人深思的问题。

依据进化论的观点突变应是一种不受环境影响的随机发生过程，这已得到彷徨变异实验和影印平板等实验的证实［5］。从本质上讲，细菌耐药基因突变属于一种进化形式，其突变模式也应遵从随机过程的一般规律。但关于耐药结核病发生的一般机制，则有优势学说和顺次选择学说认为:结核杆菌在繁殖过程中，极少菌株自然突变形成耐药菌，在抗结核药物选择性压力存

在情况下，此种自然突变发生的频率可能增加［6］。这就说明:在危及细菌生命安全的情形之下，突变似乎并不完全随机，而有定向突变的倾向。这对我们深刻理解不同报道间上述位点突变率之间的差异也许有益。我们也许可以如此朴素地思维:531 位的丝氨酸是RFP 最为关键的作用的靶位，MTB 在531 位产生碱基突变是其最为直接和简化的“趋利避害”方式。另一方面，我们知道:在生物界中，各种生物采用较为通用的遗传达室法则，即应用64 上可能的三联体密码子中的61 个编码20 种不同的氨基酸，为降低突变对物种变化的影响，一种氨基酸可能由几个密码子编码，编码同一氨基酸的多个密码子仅在第三位碱基上存在差异［7］。但我们可以从表2 看到:MTB rpoB 基因531、526、516 三个位点发生同义突变(即单独第三碱基突变)的几率近乎为零，而多为第一、第二碱基的单碱基突变，这也说明MTB 的耐药基因突变并非随机，而是以较为特定的方式。此种特定的方式我们可以总结为:①碱基突变多导致有义突变;②尽力避开其本身的基因复制“纠错机制”，以单碱基突变为主。我们认为:在强大的抗结核药物环境压力下，MTB 以此种最为“经济”而简约的方式达则可较高效率地达到基因突变的目标以利于其生存，符合生物进化的一般原则。此种推测是否妥当，有等更进一步的研究予以证实。

表2 3062 株中国利福平耐结核杆菌rpoB 基因531、526、516位点突变情况

从表2 还可看到:突变率最高的531 位点碱基突变主类型较为单一，而526、516 位碱基突变主类型则相对分散。为何如此?目前我们不得而知。至于531、526、516 位点与其它位点的联合突变，由于发生率不高，本文未进行详尽分析。这些都有待人们进行深入探索。

［1］ LIN SY，DESMOND EP. Molecular diagnosis of tuberculosis and drug resistance［J］. Clin Lab Med. 2014，34(2):297 -314.

［2］ 卓文基，刘志辉，钱 明，等.一线抗菌素结核药物不同耐药表型的利福平耐药结核杆菌rpoB 基因突变分析［J］.现代医院，2014，14(4):4 -6.

［3］ 孟繁荣，刘志辉，谢 贝，等. 我国利福平敏感结核杆菌rpoB基因利福平耐药定区序列循证分析［J］. 实用医学杂志，2013，29(21):3601 -3604.

［4］ 吴雪琼，张宗德，乐 军.分枝杆菌分子生物学［M］. 北京:人民军医出版社，2010:125 -139.

［5］ 王凤阳，杜 丽，何洪彬.细菌分子遗传学(原书第5 版)［M］.北京:科学出版社，2013:27 -50.

［6］ 唐神结，许绍发，李 亮.耐药结核病学［M］. 北京:人民军医出版社，2014:27 -29.

［7］ 江松敏. Lewin 基因Ⅹ［M］. 北京:科学出版社，2013:762 -793.