Foxp3-3279 基因多态性与成人牙周炎的关系

杨伟珍 邝桂星 苏 丹 陈盛强

牙周病是一种多因素炎症性破坏性疾病，一些危险因素，如基因、环境或宿主免疫系统等会加重病情，有家族聚集性。由于牙周炎早期多无明显自觉症状，如果早期的牙龈炎没有及时发现、治疗，炎症可由牙龈向深层扩散至牙周膜、牙槽骨而发展成牙周炎。严重的牙周炎不能保留牙齿，本研究将比较Foxp3 -3279 各位点基因型和等位基因在牙周炎病人和正常对照组的分布，寻找在牙周炎病人中差异表达的基因，为牙周炎的的发病机制提供一定的免疫学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集2011 ～2014 年广州市番禺区石碁人民医院和番禺南村医院口腔门诊重度成人牙周炎患者共50 例，其中男23 例，女27 例;年龄38 ～61 岁，病程5 年～30 余年，所有患者都进行牙骨X 线拍摄结合临床检查确诊，诊断标准参照《中华口腔学》，经检查排除牙周炎疾病的103 例健康对照者，年龄与患者组相当，对照组的年龄及性别和牙周炎患者组均无统计学差异，所有检测者近期均未服用影响检测的药物。

1.1.2 材料 从基因库检索Foxp3 基因序列，根据序列使用Primer Premer5.0 设计Foxp3 -3279 位点引物，并使用NCBI 的Blast 软件对引物的特异性进行检验。Foxp3 -3279 位点PCR 引物序列如下:正向引物［A］5＇ - CTGGCTCTCTCCCCAACTGA -3＇，［C］5＇ - CTGGCTCTCTCCCCAACTGC -3＇ 反向引物R5＇ -ACAGAGCCCATCATCAGACTCTCTA - 3＇。引物，标本基因组DNA 抽提试剂和PCR 试剂购自上海生工生物技术有限责任公司。

2 方法

2.1 标本基因组DNA 制备，采集研究对象EDTA 抗凝血5 ml，常规使用苯酚-氯仿抽提法从外周血白细胞中提取DNA。

2.2 Foxp3 - 3279 位点基因的检测 PCR - SSP(polymerase chain reaction with sequence -specific primers)法，在灭菌的0.2 mL 离心管中，按顺序分别加入:模板DNA 3.0 μl，10 ×PCR Buffer 3.0 μl，Taq DNA 酶1.0 μl，DNTP 3.0 μl，Primer 1 和2 各1.0 μl，加水至总积为30 μl。94℃预变性240 s，94℃变性55 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，进行30 次PCR 循环;72℃充分延伸7 min。

2.3 目的基因的鉴定 在1.5%琼脂糖凝胶中对扩增基因片段进行电泳。

2.4 统计学分析 使用SPSS12.0 统计软件对数据进行分析，计算牙周炎组和对照组Foxp3 -3279 位点各基因型频率和等位基因频率，组间比较用卡方检验。

3 结果

用Foxp3-3279 位点A 等位基因和位点C 等位基因特异性引物进行PCR 扩增，可见大小约333 bp 和334 bp 片段，与预期目的基因片段大小相符。C 等位基因引物扩增CC 基因型纯合子，A 等位基因引物扩增AA 基因型纯合子，如果同时出现阳性条带的基因型则判断为AC 杂合子，PCR 电泳结果见图1。随机选取PCR 电泳进行序列测定，结果显示:AC、AA 和CC 三种基因型与PCR 结果相符(见图2)。

图1 Foxp3 -3279 位点基因型PCR-ARMS 分析电泳图

图2 Foxp3 -3279 位点各基因型测序图

表1 牙周炎和正常组Foxp3 -3279 位点基因型及等位基因频率n(%)

表1 的结果显示:Foxp3 -3279 位点CC、CA、AA 三种基因型频率在牙周炎患者中分别为74%，24%和2%;在正常对照中分别为72.82%，24.27%和2.91%，提示Foxp3 -3279 各位点基因型和等位基因在牙周炎组和正常组之间分布差异无显著性。

4 讨论

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周组织(牙周膜、牙槽骨和牙骨质)的慢性炎症性破坏性疾病。粘附着于牙齿或口腔组织的微生物，易形成牙菌斑，并且持续发展分泌许多炎性因子，导致正常组织的功能紊乱，表现为牙周炎患者外周血白细胞的功能缺陷，趋化能力降低、吞噬及杀菌能力下降、粘附功能升高，这些改变主要是由于炎症细胞因子、地诺前列酮增多，白三烯β4、IL-10、TGF-β 和金属蛋白酶等减少，提示适应性免疫应答在牙周炎的发病过程中起一定的作用。

Foxp3 是Fox(Forkhead box)家族转录因子中的一员，是X染色体上基因编码的叉头样转录因子，特异性表达于调节性T淋巴细胞(CD4+CD25+Treg 细胞)，并对其的分化、发育和功能维持有重要作用［1］。而表达Foxp3 的CD4 +CD25 +Treg 细胞可以抑制体外TCR 刺激下T 细胞活化和增殖。研究还发现Foxp3mRNA 在外周血单个核细胞中的CD25 -和CD8 +细胞受到刺激后也可以表达Foxp3mRNA。人类FOXP3 基因存在多种突变，可引起免疫失调性基因疾病、多发性内分泌腺体病、X-相关综合症(IPEX)等，故对于整体免疫失调的多种自身免疫性疾病来说检测CD4+CD25 +Treg 细胞上Foxp3mRNA 可直接反映体内CD4+CD25+Treg 细胞的状态。

牙周炎的病因和发病机制较为复杂［2-4］，牙周炎的主要的病理改变是牙周组织炎症细胞浸润、结合上皮附着丧失、牙周袋形成、牙槽脊顶开始吸收及牙周膜间隙增宽。牙周组织受破坏这个改变的过程，涉及多项信号调控通路。研究认为Th0 前体细胞向Th1/Th2 细胞分化过程中平衡失调，向Th1 细胞分化过度至其功能相对亢进，Th1 型细胞因了可增加牙槽骨的吸收，而Th2 细胞分化较弱致其功能不足，Th2 型细胞因子对牙周组织有保护作用，认为这改变与牙周病的发病密切相关。健康人正常牙龈组织中有一定数量CD4+CD25 +Treg 细胞，出现牙周炎时，其数量会减少，或者CD4 +CD25 +Treg 细胞数量不减少，但会有免疫功能障碍［5］，Foxp3 表达水平降低。牙周的CD4 +CD25 +Treg 细胞受细菌侵入刺激后分泌TGF-β、IL-10 等发挥抑制过强的免疫应答，防止组织破坏的病理性应答的发生。而TGF-β可诱导T 细胞表达Foxp3，通过IL-2、IL-10 发挥调节作用。有研究报道［6］Foxp3 的mRNA 表达和调节性T 细胞的在功能上是有关联的，缺乏功能性Foxp3 基因会引发多种自身免疫性疾病，说明Foxp3 在调控CD4 +CD25+Treg 细胞活化中起到重要的作用。Rudensky 等通过向小鼠注入CD4+CD25 +Treg 细胞可以预防淋巴细胞增生失调的发生，再证实了Foxp3 的缺失可导致CD4+CD25+Treg 细胞的不足，进而引起免疫功能失调。有人通过免疫组化和实时定量RT-PCR 证实了牙周炎患者Foxp3 表达存在下调现象［7］。这些研究表明牙周炎的患者存在调节性T 细胞抑制效应的缺陷，由于产生促炎性细胞因子的效应性CD4 +T 细胞和分泌抑炎性细胞因子的CD4 +CD25 +Treg 细胞(调节性T细胞)之间的平衡出现异常可能导致Th2 细胞因子优势表达。然而体机如何调控效应性细胞和调节性T 细胞之间的平衡，目前还不清楚。Fontenot［8］研究表明Foxp3 在调节性细胞表达具有特异性，而Foxp3 基因编码产物的功能缺失可造成CD4 +T 细胞相关淋巴细胞增生病。张青等［9］研究表明调节性T 细胞的改变与再生障碍性贫血密切相关。人类Foxp3 基因有多种突变，其中-3279 位点研究得较多，Zhang L 等［10］、马秋茹等［11］和杨韶艳等［12］研究己发现Foxp3 -3279 基因多态性位点分别与过敏性鼻炎、系统性红斑狼疮、斑秃发病相关。我们也对牙周炎的Foxp3 基因-3279 位点基因多态性进行了检测，研究该基因是否与牙周炎的发病相关，但是结果表明牙周炎的Foxp3-3279 各基因型频率和基因频率与正常对照组相比，各等位基因无显着性差异。提示牙周炎可能与Foxp3 -3279 基因多态性无关联。牙周病发病率较高，是成人失牙的主要原因，严重影响生活质量，因此有必要探究其他细胞因子的多态性位点及其它危险因素，分析确定牙周炎致病机制，为该病的治疗和预防提供依据。

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