水解反应对菜籽蛋白生物利用度的影响研究

罗 敏 马海乐，2 何荣海 程 宇 周存山金 建 郭晶晶 郝俊杰

（江苏大学食品与生物工程学院1，镇江 212013）

（江苏省农产品物理加工重点实验室2，镇江 212013）

水解反应对菜籽蛋白生物利用度的影响研究

罗 敏1马海乐1，2何荣海1程 宇1周存山1金 建1郭晶晶1郝俊杰1

（江苏大学食品与生物工程学院1，镇江 212013）

（江苏省农产品物理加工重点实验室2，镇江 212013）

研究了菜籽蛋白经酶解后在生物体内的生物利用，考察了水解度对菜籽蛋白生物利用度的影响。将雄性SD大鼠64只，随机分成8组，即无氮组、酪蛋白组、菜籽蛋白组、水解度（DH）为4%、8%、12%、16%、20%的水解组，每组8只。大鼠在膳食平衡3 d之后，开始进行代谢试验，测其真消化率、表观消化率、净蛋白利用率、生物价指标。连续饲喂21 d之后，记录SD大鼠的体重变化和日粮消耗量，计算蛋白功效比值和净蛋白比。结果表明，真消化率、表观消化率、蛋白功效比值、净蛋白比和SD大鼠体重随水解度的增大有降低的趋势，DH 4%组与菜籽蛋白组相比无显著差异（P＞0.05）。菜籽蛋白水解之后的净利用率要高于未水解的蛋白，但差异不显著（P＞0.05）。与菜籽蛋白组相比，DH 4%组的生物价就已经有了显著的提高（P＜0.05）；而与水解度更高的组相比，DH 4%组生物价无显著变化（P＞0.05）。综合考虑，说明DH 4%组具有较高的生物利用度，是适合人类食用的优质蛋白。

菜籽蛋白 水解反应 水解度 生物利用度

我国油菜籽种植面积和产量均居世界第一，菜籽粕作为菜籽油加工的副产品，所含菜籽蛋白较高，为35%～42%。菜籽蛋白氨基酸组成合理，富含赖氨酸，几乎不存在限制性氨基酸，是重要的蛋白质资源［1-3］。但是目前较为常用的压轧制油工艺导致蛋白变性严重，影响着饼粕蛋白的消化利用效率。对于我国这一蛋白质非常匮乏的国家来说，有必要通过适度酶解的方法提高其生物利用度，提升其开发利用的价值。同时，酶解过程产生的一些肽类小分子营养物质在人体中也会发挥重要的生理活性功能［4-5］。

“生物利用度”这一概念在医药行业中广泛使用，它能够反映所给药物进入人体循环的药量比例，描述口服药物由胃肠道吸收之后，经过肝脏后而到达体循环血液中的药量占口服剂量的百分比［6］。相对应的，作为蛋白质产品品质的重要衡量指标，蛋白的生物利用度可以用表观消化率、真消化率、净蛋白利用率、生物价等指标来衡量。目前，对蛋白的消化率的测定主要有2种方法：体外法和体内法。体外消化法是利用消化酶在试管内进行消化试验，从而快速测定原料的相对利用率，其优点是简单、快捷。但是，蛋白在体内的消化、吸收、利用是一个非常复杂的过程，体外消化法无法反应体内消化的真实情况。本研究采用国际上通用的蛋白质营养评价方法（AOAC），对生长期SD大鼠进行了氮代谢的试验研究，能够准确评价蛋白的生物利用度。

本试验以菜籽蛋白为原料，为阐明不同水解度蛋白吸收、转化及利用机制，针对不同水解度的菜籽蛋白质，从动物水平研究确定不同水解度菜籽蛋白的吸收、转化和利用的代谢规律，探明蛋白质的生物转化过程及与水解度的关系，为提高蛋白的生物利用，特别是为消化代谢能力较差的患者提供易吸收、生物利用度高的特殊膳食食品的指导。

1 材料与方法

1.1 原料

菜籽蛋白（含水率9.9%，蛋白质质量分数53%）：湖北维普生物科技有限公司；碱性蛋白酶Alcalase 2.4L FG（2.4 AU）：诺维信生物技术有限公司；酪蛋白粉：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

PHS-2C型数显pH计：上海理达仪器有限公司；HH-S型数显恒温水浴锅：江苏省金坛市医疗仪器厂；LD5-2A型离心机：北京医用离心机厂；UDK 149型凯氏定氮仪：意大利VELP仪器有限公司。

1.3 试验动物

初断乳的SD雄性大鼠64只，体重44 g左右，江苏大学动物试验中心提供。

1.4 试验方法

1.4.1 不同水解度菜籽蛋白的制备

称取菜籽蛋白原料，配成的蛋白水溶液21.2 g／L，置于水浴锅中，待其温度达到50℃，调节溶液pH值为9.0后迅速加入1.17 g／L Alcalase2.4L FG，进行水解，反应中滴加5 mol／L NaOH，采用pH-stat法维持在所需要的pH值，并测定DH值。水解完之后，100℃水浴下灭酶处理10 min。分别制备DH为4%、8%、12%、16%和20%的菜籽蛋白水解液，为后续SD大鼠饲料的制备做准备。

水解度按照pH-stat法［7］进行测定，蛋白含量按照微量凯氏定氮法进行测定，以下相同。

1.4.2 不同水解度菜籽蛋白的产物转化率

蛋白经水解之后，上清液中的含氮量占底物蛋白含氮量的百分比被定义为产物转化率，即

产物转化率＝（上清液中的含氮量／底物蛋白含氮量）×100%

菜籽蛋白经水解、灭酶后，冷却至室温，在3 500 r／min下离心10 min，收集上清液，用凯氏定氮法测定上清液的含氮量。测定不同水解度下产物转化率。

1.4.3 动物分组与饲养

SD大鼠按体重顺序，随机分为8组，每组各8只，各组动物平均体重组间差不大于5 g，组内体重差不大于10 g。SD大鼠在江苏大学动物房内分笼饲养，室温控制为（24±1）℃，室内相对湿度（RH）＝（60±5）%，自由进食饮水。参照AOAC991.29中蛋白质的表观消化率测定方法中饲料要求配制实验动物饲料，具体配方：蛋白10%、维生素1%、矿物质3.5%、膳食纤维5%、玉米油10%、其他由玉米淀粉补充到100%。

动物饲养称重试验分为水解度为4%、8%、12%、16%和20%5个试验组和酪蛋白组、菜籽蛋白未水解组与无氮组3个对照组。5个不同水解度组蛋白质量分数分别为：10.69%、9.98%、10.33%、11.02%、10.96%；酪蛋白组和菜籽蛋白未水解组蛋白质量分数分别为：9.81%和10.4%；无氮组大鼠饲以无氮饲料。

1.4.4 氮代谢试验

蛋白质的真消化率、表观消化率、净蛋白利用率和生物价指标是氮代谢研究的主要指标，科学研究中习惯上用氮的代谢来表示蛋白质的代谢。蛋白质的真消化率（True digestibility，TD）是指食物蛋白质中被消化吸收的氮量占该蛋白质总氮量的百分比；粪代谢量较低，如略去不记的话，则测得的结果称为表观消化率（Apparent digestibility，AD）［8］；净蛋白质利用率（Net protein utilization rate，NPUR）是指在一定的条件下，体内储留的蛋白质量占摄入蛋白质量的百分比，是生物学方法评价食物中蛋白质营养质量的常用指标之一，用来表示摄入的蛋白质在体内实际被利用的程度［8］；蛋白质的生物学价值简称“生物价”或“生物效价”（Biological value，BV），指食物中蛋白质经消化吸收后在体内被利用的氮量（贮留氮量）占被吸收氮量的百分比［8］。

氮代谢试验包括3 d的适应期和5 d的平衡期。在平衡期内，记录每天大鼠所消耗的饲料，并收集大鼠的粪便和尿液，置于-20℃的冰箱保存，用于对饲料真消化率、表观消化率、净蛋白利用率、生物价指标的测定［8］。上述4项指标计算公式为：

TD＝［食物总氮量-（粪氮量-粪代谢氮）／食物总氮量］×100%

AD＝（食物总氮量-粪氮量／食物总氮量）×100%

NPUR＝［食物总氮量-（粪氮-代谢氮）-（尿氮-内生氮）／食物总氮量］×100%

BV＝［食物总氮量-（粪氮-代谢氮）-（尿氮-内生氮）］／［食物总氮量-（粪氮-代谢氮）］×100%

1.4.5 大鼠生长试验

蛋白质功效比（Protein efficiency ratio，PER）又称“蛋白质效价”，为测定摄入单位质量蛋白质的体重增加值，一般指按规定的方法（AOAC法），在规定的喂养时间内（通常为14～28 d），测量动物体重增加量与蛋白质摄入量，进行计算。净蛋白比（Net protein ratio，NPR）是在蛋白质功效比的基础上改进而来，即考虑到无氮组动物体重的减轻。

以无氮组、酪蛋白组、菜籽蛋白未水解组为对照组，用不同水解度菜籽蛋白饲养SD大鼠，测定大鼠体重的变化，观察大鼠的生长性能。每3 d和周末测量1次大鼠的体重及所消耗的饲料，试验期为21d，并计算蛋白功效比值和净蛋白比［8］。计算公式为：

PER＝体重增加值（g）／蛋白质摄入量（g）

NPR＝（试验动物体重的增加值（g）+无氮组动物体重减轻值（g））／蛋白质摄入量（g）

1.4.6 统计方法

试验结果用均数±标准差表示，采用SPSS17.0统计软件中的单因素方差分析进行统计学分析。

2 结果与讨论

2.1 菜籽蛋白水解度对产物转化率的影响

菜籽蛋白酶解之后，不同水解度对应的产物转化率如图1所示。从图1可以看出，随着水解度的增大，其产物转化率也增大。在较低水解度时，产物转化率与水解度基本上呈线性正相关，在较高水解度时，产物转化率增长较缓慢。原因可能是初步水解时，主要是菜籽蛋白大分子的断裂；当水解度较大时，越来越多的可溶性多肽参与到酶解过程中来，因此，转化率与初始水解时相比，增长得较缓慢。

图1 不同水解度菜籽蛋白对应的产物转化率

2.2 水解度对菜籽蛋白真消化率和表观消化率的影响

消化率能反映食物蛋白质在消化道内被分解和吸收的程度。不同水解度对菜籽蛋白真消化率和表观消化率的影响结果如表1。数据显示，其他各组与酪蛋白组相比，蛋白的真消化率和表观消化率要明显的低（P＜0.01）。菜籽蛋白组与DH 4%组相比，真消化率和表观消化率无显著差异（P＞0.05），但是与其他各菜籽蛋白水解组相比，真消化率和表观消化率要高，有显著差异（P＜0.05）；各水解组之间均无显著差异（P＞0.05）。从整体看，菜籽蛋白经水解之后，其平均真消化率和表观消化率反而有所降低。

表1 不同水解度对菜籽蛋白真消化率和表观消化率的影响／%

2.3 水解度对菜籽蛋白净利用率的影响

蛋白净利用率越高，说明机体对蛋白的利用更加完全彻底。水解度对菜籽蛋白净利用率的影响结果如表2所示。与其他组相比，酪蛋白组蛋白的净利用率最高，差异极显著（P＜0.01）。不同菜籽蛋白水解组的平均净利用率值均要高于菜籽蛋白未水解组，但没有显著性差异（P＞0.05）。说明，菜籽蛋白水解在一定程度上有助于SD大鼠对菜籽蛋白的利用。

2.4 水解度对菜籽蛋白生物价的影响

蛋白质的生物学价值可表示其消化吸收后的利用程度，也是衡量体内代谢的常用指标之一。水解度对菜籽蛋白生物价的影响结果见表3，从表3可以看出，菜籽蛋白的生物价要明显低于酪蛋白的生物价（P＜0.01）；各水解组与酪蛋白组相比，无显著差异（P＞0.05）。与菜籽蛋白未水解组相比，各水解组的生物价都要高（P＜0.05）；各水解组之间生物价无显著变化（P＞0.05）。结果说明，菜籽蛋白经低程度水解之后，生物价得到显著提高，当进一步水解后，生物价变化不明显。蛋白的水解有助于蛋白消化吸收后的利用。

2.5 不同水解度菜籽蛋白对SD大鼠体重的影响

通过21 d不同水解度蛋白饲料对SD大鼠的饲养试验，测定了不同水解度菜籽蛋白对大鼠生长性能的影响，结果见表4。所有SD大鼠在试验3周内，正常进食饮水，排泄物和分泌物没有异常，毛色顺滑，没有发现明显的食物中毒现象，也没有动物异常死亡。

表4显示了SD大鼠的体重变化，从体重增长趋势来看，无氮组由于饲料不含蛋白，大鼠体重随着试验的进行逐渐减少，其他组的大鼠随着时间的延长，体重增加。在初始体重相差很小的情况下喂食各种饲料，饲养1周后，除了无氮组，各组体重差异不明显（P＞0.05）。饲养2周后，与酪蛋白组相比，菜籽蛋白组、DH 4%和DH 8%这3组体重均比酪蛋白组要高（P＜0.05）；DH 16%和DH 20%的组与DH 4%的组比，体重有所降低 （P＜0.05）。饲养3周后，与酪蛋白组相比，菜籽蛋白组、DH 4%和DH 8%的组体重要高，且差异极显著（P＜0.01），DH 12%的组体重也要高，有显著性差异（P＜0.05）；与菜籽蛋白组和 DH 4%相比，DH 12%、DH 16%和 DH 20%的体重都要低（P＜0.05）。由以上分析表明，菜籽蛋白组和DH 4%的组大鼠的生长性能较好，随着菜籽蛋白水解度的增大，大鼠平均体重有降低的趋势。

表2 不同水解度对菜籽蛋白净利用率的影响／%

表3 不同水解度对菜籽蛋白生物价的影响／%

表4 不同水解度菜籽蛋白对SD大鼠体重（g）的影响

2.6 水解度对菜籽蛋白功效比值及净蛋白比的影响

水解度对菜籽蛋白功效比值和净蛋白比的影响结果如表5所示。蛋白质功效比反映出蛋白质在体内的利用程度及其效率［5］。菜籽蛋白组及DH 4%的组功效比值较高，两者之间无明显区别；与酪蛋白组及DH 12%、DH 16%和DH 20%的组相比，有显著性差异（P＜0.05）。对于净蛋白比这一指标而言，菜籽蛋白组和DH 4%的组与酪蛋白相比，无显著差异，跟DH 12%、DH 16%和DH 20%相比，都有显著差异（P＜0.05）。整体而言，菜籽蛋白水解之后，随着水解度的增大，其功效比值和净蛋白比有降低的趋势，且在较高水解度时，如DH 16%和DH 20%，则功效比值和净蛋白比基本不变。

表5 不同水解度对菜籽蛋白功效比值和净蛋白比的影响

3 结论

本研究在证明各不同蛋白饲料安全无毒的基础上，以刚断乳的SD大鼠为研究对象，以酪蛋白、未水解菜籽蛋白、无氮饲料为对照组，揭示了水解度对蛋白生物利用度的影响。结果表明：真消化率、表观消化率、净蛋白比、蛋白功效比值和SD大鼠体重随水解度的增大有降低的趋势；DH 4%的组与菜籽蛋白组相比无显著变化（P＞0.05）。菜籽蛋白各水解组的净利用率要高于菜籽蛋白未水解组，但差异不显著（P＞0.05）。与菜籽蛋白组相比，DH 4%组的生物价有显著的提高（P＜0.05）；而与水解度更高的组相比，生物价无显著变化（P＞0.05）。综合考虑，说明DH 4%的组具有较高的生物利用度，即菜籽蛋白低程度的水解有利于提高其生物利用度。本试验只是研究了不同水解度菜籽蛋白的消化、代谢和吸收规律，对于复杂的形成这些规律的根本原因有待进一步研究。

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The Effect of Hydrolysis Reaction on the Bioavailability of Rapeseed Protein

Luo Min1Ma Haile1，2He Ronghai1Cheng Yu1Zhou Cunshan1Jin Jian1Guo Jingjing1Hao Junjie1
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University1，Zhenjiang 212013）
（Jiangsu Provincial Key Laboratory for Physical Processing of Agricultural Products2，Zhenjiang 212013）

The effect of enzymolysis on bioavailability of rapeseed protein was studied in the paper.Total 64 male Sprague-Dawley（SD）ratswere selected and divided into 8 groups as protein-free group，control group（casein group），rapeseed protein group and 5 hydrolysate groupswith DH of4%，8%，12%，16%and 20%，respectively.Feed protein-free diet concurrently with test diets，in duplicate for 3-day preliminary period and 5-day balance period respectively，the apparent digestibility（AD），true digestibility（TD），net protein utilization rate（NPUR）and biological value（BV）was determined.Protein efficiency ratio（PER）and net protein ratio（NPR）were studied by calculation of theweight gain and feed consumed.The animal test revealed that AD，TD，PER associated with NPR at higher DH had a relatively lower value.The DH of 4%group showed no significant difference compared with the rapeseed protein group（P＞0.05）.The NPUR value of protein hydrolysate groups were higher than that of the rapeseed protein group，but there was no significant difference（P＞0.05）.The BV of DH of 4%group was significantly different from the rapeseed protein group（P＜0.05）and demonstrated little change compared with the higher DH groups（P＞0.05）.The results indicated that the DH of4%group had a higher bioavailability，which could be a good protein resource for the human.

rapeseed protein，hydrolysis reaction，hydrolysis degree，bioavailability

Q519

A

1003-0174（2015）07-0023-05

863计划（2013AA102203）

2014-01-26

罗敏，女，1989年出生，硕士，高生物利用度蛋白的制备

马海乐，男，1963年出生，教授，食品生物技术以及生物能源