松仁蛋白对小鼠抗氧化能力的影响

吴晓红 杨传平

（东北林业大学交通学院1，哈尔滨 150040）

（东北林业大学林学院2，哈尔滨 150040）

松仁蛋白对小鼠抗氧化能力的影响

吴晓红1杨传平2

（东北林业大学交通学院1，哈尔滨 150040）

（东北林业大学林学院2，哈尔滨 150040）

通过建立D-半乳糖诱导的衰老小鼠模型，研究松仁蛋白对衰老小鼠的抗氧化作用。随机将SPF级雄性小鼠60只分为正常对照组（12只）和模型组（48只）。模型组致衰后，按照小鼠体内MDA水平分成4组，各组灌胃不同剂量松仁蛋白。测定各组小鼠血清、肝及肾组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、总超氧化歧化酶（SOD）等指标的变化。发现松仁蛋白显著的降低了小鼠体内MDA生成，增强了机体SOD、CAT、GSH-Px活力，饲喂剂量中500 mg／（kg·d）影响效果最显著。松仁蛋白对延缓小鼠衰老有一定作用。

松仁蛋白 小鼠 抗脂质氧化能力

红松（Pinus konaiensis Sieb et Zucc）松属松科植物，是我国东北地区重要的经济树种，红松种子是一种具有很高营养价值的坚果，蛋白质量分数达20%左右，研究发现红松仁蛋白具有一定的生理活性功能［1-3］，是一种很好的植物蛋白来源。自20世纪80年代以来，掀起了一股开发、研究和利用天然抗氧化剂的热潮［4-5］，关于植物蛋白抗氧化作用方面的研究有相关的研究报道，大豆蛋白对大鼠抗脂质氧化能力有改善作用［6］，富硒灵芝中不同蛋白提取物具抗氧化活性［7］，小球藻糖蛋白、鹰嘴豆蛋白、白果活性蛋白、核桃蛋白都具有抗氧化活性［8-11］，从红松仁中提取得到的组成蛋白已经初步确定具有清除自由基的作用［12］，本研究主要是研究红松仁蛋白对小鼠体内MDA生成、机体SOD、CAT、GSH-Px活力等方面的影响，进一步确认松仁蛋白的抗氧化活性，为松仁蛋白在功能食品、化妆品和药品等方面的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

1.1.1 试验材料

红松籽：市售；红松仁蛋白（在松仁总蛋白中的质量分数为52.55%）：自制。

实验动物：昆明种小鼠，购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物养殖中心，合格证号SCXK（黑）2006-008，实验室许可号 SYXK（黑）2013-012，经过东北林业大学动物伦理管理委员会同意。

1.1.2 主要试剂

超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、蛋白质含量测定试剂盒（考马斯亮蓝法）：南京建成生物制剂公司。

1.1.3 主要设备

722型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；FD-1型冷冻干燥机：北京博医康试验仪器有限公司；3K-30超速离心机：美国Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 松仁蛋白制备

红松籽去壳脱红衣，传动杆法碾碎，索氏法脱去脂肪，得到脱脂松仁粉，取一定量的脱脂松仁粉，按1∶20的比例加入蒸馏水，35℃水浴并用增力电动搅拌器匀速搅拌 90 min，然后以 4 000 r／min离心10 min，弃沉淀取上清液，上清液调节pH值至4.0，静置30 min，沉淀，以 4 000 r／min离心 10 min，弃上清液取沉淀，将沉淀洗涤，以上操作重复2遍，合并沉淀透析，在-40℃下预冻24 h，再转入真空冷冻干燥机干燥，即得松仁蛋白。

1.2.2 松仁蛋白急性毒性试验

霍恩急性毒性试验设计方法：GB 15193.3—2003。

松仁蛋白的急性毒性试验设计：室温（22±3）℃，相对湿度30%～70%，无对流风。选用昆明种健康小鼠48只SPF级，雌雄各半，体重（18～22）g，随机分为4组，每组12只，雌雄各半。设定4个剂量组，对每组小鼠1次灌胃达到设定的剂量，灌胃后第2天起计算，观察14 d内动物的死亡情况。

1.2.3 动物分组及建立衰老模型

选18～22 g昆明种健康小鼠60只，SPF级，雄性，随机分为正常对照组（12只）和模型组（48只），模型组用D-半乳糖1 000 mg／（kg·d）腹腔注射造模，每日1次，连续6周。取血测定已造模小鼠血清中MDA含量，按照MDA水平分组。随机分为模型对照组（12只）和高剂量组（12只）、中剂量组（12只）、低剂量组（12只）4组，3个剂量模型组分别灌服100、500和 1 000 mg／（kg·d）松仁蛋白，连续灌胃30 d。正常组和模型对照组灌服同体积的生理盐水，同时模型组继续腹腔注射相同剂量的D-半乳糖；自由饮食饮水。

1.2.4 松仁蛋白对小鼠抗氧化作用

各组小鼠连续灌胃30 d后，最后1次灌胃后禁食12 h，可以自由饮水，断头取血，取肝脏和肾脏。

取肝脏和肾脏各0.2 g，分别加入9倍的生理盐水，用组织匀浆机匀浆至无块状组织存在，将匀浆液倒入离心管，以3 000 r／min于4℃离心15 min，取上清液测定各指标。

血液采集后直接离心，取血清，测定各指标。主要测定血清、肝及肾组织中MDA含量、SOD活性、CAT活性及GSH-Px的活性和组织中总蛋白含量，各测定指标的测定参照试剂盒说明方法测定。

1.3 统计分析

采用SPSS 13.0统计学软件。组间比较采用t检验，P＜0.05时为显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 松仁蛋白急性毒性

松仁蛋白急性毒性试验结果见表1。在14 d内，4个剂量组均无小鼠死亡，小鼠经口灌胃LD50值＞21.5 g／kg，红松仁水溶性蛋白按照我国食品安全性毒理学评价的6级标准，属无毒物质。

表1 松仁蛋白急性毒性试验结果

2.2 小鼠肝及肾组织匀浆总蛋白含量

对表2的数据进行方差分析，t检验，结果显示，各受试组与空白对照组均没有显著差异（P＞0.05），说明松仁蛋白对小鼠肝、肾组织匀浆的总蛋白含量没有影响。

2.3 小鼠血清、肝及肾组织匀浆SOD活性

SOD酶是体内去除自由基的有效因子，从表3可以看出，正常对照组与模型组小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型对照组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的SOD的活力比正常对照组较显著降低（P＜0.01），而 100、500和1 000 mg／kg 3个剂量组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的SOD活力则比模型对照组显著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／（kg·d）剂量组较模型对照组较显著增加（P＜0.01），血清、肝及肾组织匀浆中SOD活力分别增高22.49%、25.86%和8.63%。从试验的结果看，松仁蛋白可以作为一种抗氧化剂，能够增强体内的SOD活性，是较理想的抗衰老营养品。

表2 小鼠肝组织匀浆和肾组织匀浆总蛋白含量（X±s）

表3 小鼠血清、肝组织匀浆及肾组织匀浆中SOD活性±s）

表3 小鼠血清、肝组织匀浆及肾组织匀浆中SOD活性±s）

注：a：与正常对照组比较；b：与模型对照组比较，**较显著差异（P＜0.01），*显著差异（P＜0.05）。下同。

1%肾组织匀浆SOD活力12 257.53±23.45 289.53±20.67 219.38±19.98模型对照组 0 12 198.78±27.17a** 201.18±25.19a** 198.27±25.77a**低剂量模型组 50 12 201.68±30.35b* 231.63±27.52b* 175.98±29.33b*中剂量模型组 100 12 243.49±31.58b** 253.21±29.18b** 215.41±27.78b**高剂量模型组 200 12 226.79±29.45b* 247.53±29.09b* 193.21±26.31b／U／mg prot正常对照组组别 蛋白剂量／mg／（kg·d） 动物数／只 血清SOD活力／U／mL 1%肝组织匀浆SOD活力／U／mg prot 0*

2.4 小鼠血清、肝及肾组织匀浆CAT活性

羟自由基是化学性质最活泼的活性氧，它对机体的破坏性极强，可以被CAT分解，测定CAT的活性可间接反映机体清除自由基的能力，衡量组织细胞抗氧化保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活。CAT分解过氧化氢的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的过氧化氢与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405 nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力，各组小鼠血清、肝、肾组织CAT活力见表4。

表4 小鼠血清、肝组织匀浆和肾组织匀浆中CAT活性（X±s）

表5 小鼠血清、肝组织匀浆和肾组织匀浆中GSH-Px活性（X±s）

表6 小鼠血清，肝组织匀浆和肾组织匀浆中MDA含量（X±s）

从表4可以看出，正常对照组与模型组小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型对照组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的CAT的活力比正常对照组的显著降低（P＜0.05），而100、500和1 000 mg／kg3个剂量组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的CAT的活力则比模型对照组显著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500mg／kg剂量组模型对照组较显著增加（P＜0.01），血清、肝及肾组织匀浆中CAT活力分别增高21.5%、28.17%和20.14%。同时也可以看出松仁蛋白具有清除自由基的能力。

2.5 小鼠血清、肝及肾组织匀浆GSH-Px活性

GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，可以保护细胞膜结构和功能完整，GSH-Px可以促进过氧化氢（H2O2）与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成氧化型（GSSG）和水。从表5可看出，正常对照组与模型组小鼠灌喂松仁蛋白30 d后，模型对照组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的GSH-Px的活力比正常对照组的显著降低（P＜0.05）；灌胃松仁蛋白可以提高小鼠肝、肾匀浆和血清中的GSH-Px的活性，100、500和1 000 mg／kg3个剂量组均能够较显著的提高小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的GSH-Px的活力，与模型对照组比较显著增加（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／kg剂量组较模型对照组较显著增加（P＜0.01），血清、肝及肾组织匀浆中GSH-Px活力分别增高26.16%、19.64%和39.18%，说明食用松仁蛋白可以激活体内的GSH-Px的活性。GR酶是催化机体内氧化型GSH还原成GSH，GSH能和氧自由基结合，有效清除体内的自由基，保护机体免受自由基的攻击损害。

2.6 小鼠血清、肝及肾组织MDA含量

MDA是氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物的稳定存在形式，可反应机体内脂质过氧化程度。MDA含量高低可反映氧自由基水平和脂质过氧化的强度和速率，是了解氧自由基致机体细胞损伤的重要指标之一。

从表6可看出，正常对照组与模型组小鼠灌喂红松仁水溶性蛋白30 d后，模型对照组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的MDA的生成比正常对照组的MDA的生成较显著增加（P＜0.01），而 100、500和 1 000 mg／kg3个剂量组小鼠血清、1%肝匀浆组织和1%肾匀浆组织中的MDA的生成则比模型对照组显著降低（P＜0.05）。松仁蛋白500 mg／kg剂量组与其他剂量组比较，较显著抑制了MDA生成（P＜0.01）。可见，松仁蛋白可有效抑制MDA的生成，对细胞有较好的保护作用。

3 结论

经急性毒性试验证明，松仁蛋白经口LD50＞21.5 g／kg，按照我国食品安全性毒理学评价的6级标准，属无毒的物质。松仁蛋白能够显著降低小鼠体内 MDA生成，增强机体 SOD、CAT、GSH-Px活力，100、500和 1 000 mg／（kg·d）3个剂量中 500 mg／kg·d剂量影响效果最显著，结果表明松仁蛋白具有良好的抗氧化的功能。

［1］杨立宾.红松种子蛋白提取与生理功能研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2008

［2］杨丽娜.红松松仁分离蛋白的制备及降血脂功能研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2009：29-47

［3］王振宇，杨立宾，魏殿文.红松松仁中天然产物的研究进展［J］.国土与自然资源研究，2008（2）：90-91

［4］Yang Joan-Hwa，Ching Hsiu，Mau Jeng-Leun.Antioxidant properties of several commercialmushrooms［J］.Food Chemistry，2002，77（2）：229-235

［5］Paolo Scartezzini，Ester Speroni.Review on some plants of Indian traditionalmedicine with antioxidantactivity［J］.Journal of Ethnopharmacology，2000，71（1-2）：23-43

［6］李季芳，蒋卓勤，熊俊艳，等.大豆蛋白对大鼠抗氧化能力的影响［J］.解放军医学院学报，2013，34（7）：771-773

［7］杜明，赵镭，赵广华，等.富硒灵芝种不同蛋白提取物的组成特性及抗氧化活性研究［J］.食品与发酵工业，2006，32（6）：11-15

［8］魏文志，夏文水，吴玉娟.小球藻糖蛋白的分离纯化与抗氧化活性评价［J］.食品与机械，2006，22（5）：20-23

［9］薛照辉，刘珊娜，李勇，等.鹰嘴豆蛋白的制备及其抗氧化活性［J］.中国油脂，2008，33（8）：24-26

［10］黄文，谢笔钧，王益，等.白果蛋白质分离、纯化、理化性质及其抗氧化活性研究［J］.中国农业科学，2004，37（10）：1537-1543

［11］翟梦新，崔犁，郭淼，等.核桃蛋白生物活性的研究进展［J］.中国食物与营养，2013，19（6）：62-64

［12］吴晓红，王宏伟，王振宇，等.红松种子仁组成蛋白体外抗氧化研究［J］.时珍国医国药，2011，22（12）：2961-2962.

The Effect of Pine Nut Protein on Antioxidant Capacityin Mice

Wu Xiaohong1Yang Chuanping2
（Traffic college，Northeast Forestry University1，Haerbin 150040）
（School of Forestry，Northeast Forestry University2，Haerbin 150040）

Antioxidant effect of pine nut protein was studied through themodel of agingmice by D-galactose.60 SPFmalemicewere randomly divided into normal control（12）andmodel set（48）.After the agingmodelwas established successfully，according to the MDA level inmice，themalemicewere divided into four groups，each group was given different dose pine nut protein.Dfferent antioxidant parameters were measured in serum，liver tissue and kidney tissue from mice.MDA formation were significantly inhibited and SOD，CAT and GSH-Px of blood serum，liver tissue and kidney tissue increased after taking pine nut protein in agingmice.The feeding dose（500mg／（kg·d））had themost significant effect.Pine nut protein could delaymice aging process.

pine nut protein，mice，anti-lipid oxidation capacity

TS209

A

1003-0174（2015）07-0028-04

中央高校基本科研业务经费专项（DL11BA13），黑龙江省博士后研究项目（LBH-Z11269）

2014-02-19

吴晓红，女，1977年出生，副教授，天然产物有效成分功能机理及功能性食品开发

杨传平，男，1957年出生，教授，林木育种