低温射频等离子体降解乙腈中黄曲霉毒素B1的效果与途径分析

张 岩 王安妮 肖军霞 王世清 姜文利 李玉鹏

（青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109）

低温射频等离子体降解乙腈中黄曲霉毒素B1的效果与途径分析

张 岩 王安妮 肖军霞 王世清 姜文利 李玉鹏

（青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室青岛农业大学食品科学与工程学院，青岛 266109）

采用低温射频等离子体处理溶解于乙腈中的黄曲霉毒素B1，考察了时间、等离子体发射功率、黄曲霉毒素B1初始浓度对黄曲霉毒素B1降解率的影响，通过HPLC-MS／MS分析降解产物及其可能的降解途径。结果表明，随着等离子体功率的增大、黄曲霉毒素B1初始浓度的降低，其降解率有增大的趋势。200～500μg／L黄曲霉毒素B1经120 W等离子体处理150 s以上，黄曲霉毒素B1的降解率可达95%以上。经过对比等离子体处理不同时间后的黄曲霉毒素B1的一级质谱，推测准分子离子峰157、299、339为可能的降解产物峰。结合产物峰的二级质谱碎片信息和黄曲霉毒素B1分子结构中的活性位点，推断出降解产物的结构和降解路径。

低温射频等离子体 黄曲霉毒素B1降解率 降解产物

黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一种极其稳定的真菌毒素，主要有黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2，是一类结构类似化合物的总称［1］。1993年国际癌症研究机构将黄曲霉毒素划定为I类致癌物，毒性作用靶器官主要为肝脏，能引起肝炎、肝硬化、肝坏死等。其中以黄曲霉毒素B1（AflatoxinsB1，AFB1）的毒性和致癌性最强［2］。AFB1的基本结构为二呋喃环和香豆素，分子量312，易溶于乙腈、甲醇、乙醇、氯仿、油，难溶于水，不溶于乙醚、石油醚、己烷［3-5］。

黄曲霉毒素毒性大、分布广、难去除。目前降解黄曲霉毒素常用的方法主要有化学法、生物法、辐照法等，但化学法极易带来新的有机溶剂残留，生物法则由于工艺复杂难以推广，因此，本试验以射频低温等离子体作为降解手段，拟研究一种基于物理处理的高效、简捷、安全降解黄曲霉毒素的新方法［6-11］。

射频低温等离子体是利用高频高压使电极周围的空气电离而产生的低温等离子体。由于射频低温等离子的放电能量高、放电的范围大，现在已经被应用于材料的表面处理和有毒废物清除和裂解中［12-13］。射频低温等离子产生的具有高活性的电子、原子、分子和自由基能与各种有机、无机污染物分子进行碰撞和反应，使污染物分子键断裂，形成低毒或无毒的小分子化合物［14-16］。张岩等［17］运用等离子体降解水中的黄曲霉毒素 B1，降解率为51.67%。由于黄曲霉毒素B1在乙腈中的溶解性良好，本研究以乙腈为AFB1溶解介质，采用射频低温等离子体处理AFB1，并通过HPLC法测定AFB1含量，同时用HPLC-MS／MS法分析降解产物，探究等离子体降解乙腈中AFB1的效果与产物。通过对简单溶剂体系中毒素降解过程的深入研究，为在真实食品体系中研究等离子体降解黄曲霉毒素B1建立研究方法、提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素B1：美国Sigma-Aldrich公司；乙腈（色谱纯）：德国默克公司。

1.2 仪器与设备

等离子体试验装置由食品学院制作，由射频电源、射频电源匹配器、等离子体发生器、真空泵等部分组成，如图1所示。超高压液相色谱1290 Infinity喷射流离子聚焦串联四极杆6460液质联用仪：美国安捷伦公司；Elmasonic S450H智能超声波清洗器：德国艾尔玛公司。

图1 低温射频等离子体发生器

1.3 试验方法

1.3.1 等离子体处理方法

配制 200、400、500、600、800、1 000μg／L AFB1溶液，置于等离子体发生器两电极之间进行处理。等离子体处理功率设定为 80、90、100、110、120 W，每个处理重复3次，同时设定未进行等离子体处理样品为对照组。

1.3.1.1 不同等离子体发射功率对黄曲霉毒素B1降解效果的影响

初始浓度为500μg／L的AFB1溶液，置于等离子体发生器中进行处理，射频电源功率设定为80、90、100、110、120 W，处理时间 100 s。

1.3.1.2 不同等离子体处理时间对黄曲霉毒素B1降解效果的影响

初始浓度为500μg／L的AFB1溶液，置于等离子体发生器中，功率设定为120 W，分别处理50、100、150、200、250 s。

1.3.1.3 不同AFB1初始浓度对黄曲霉毒素B1降解效果的影响

取200、400、600、800、1 000μg／L的毒素溶液，分别于等离子体发射功率为120 W下进行处理，处理时间为100 s。

试样经等离子体处理后，经HPLC测定黄曲霉毒素B1含量并计算降解率。

1.3.2 HPLC测定AFB1降解率

1.3.2.1 HPLC色谱条件

Agilent液相系统，色谱柱：Waters Symmetry-C18，4.6 mm×25 0 mm，粒度5μm，柱温：30℃，流动相∶乙腈∶水 ＝（30∶70，V／V），流速：1 mL／min，进样量：20μL，荧光检测器：激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

准确吸取衍生后 0.0、0.75、1.5、7.5、37.5、75、150、225、300μg／L AFB1标准溶液 200μL，采用HPLC分析，每个浓度重复3次。以图谱中AFB1的峰面积对标准溶液的浓度进行线性回归，即得标准曲线：y＝1.753 3x-1.252 6，R2＝0.999 9。

1.3.2.3 AFB1浓度计算

参照GB／T 5009.23—2006《食品中黄曲霉毒素B1的测定》［18］，按式（1）计算样品中 AFB1的含量。

式中：C为试样中 AFB1质量浓度／μg／L；A为试样按外标法在标准曲线中对应的质量浓度／μg／L；f为试样液衍生后较衍生前的浓缩倍数。

按式（2）计算等离子体处理 AFB1的降解率［19］。式中：a为AFB1降解率／%；C为试样等离子体处理后中 AFB1质量浓度／μg／L；C0为试样中 AFB1质量初始浓度／μg／L。

1.3.3 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解产物

色谱条件：色谱柱：Agilent SB-C18，2.1 mm×50 mm，粒度1.8μm；柱温：30℃；流动相∶V甲醇∶V水＝60∶40，其中水含 5 mmol／L乙酸铵和 0.2%甲酸；流速：20μL／min；进样量：2μL。

质谱条件：离子源：ESI；扫描方式：正离子扫描；载气温度300℃；流量6 L／min；鞘气温度：300℃；流量12 L／min；扫描范围：50～400；光电倍增器电压：400 V；喷雾电压：45 psi；检测方式：MRM模式；毛细管电压：4 000 V。

1.3.4 数据分析

每个试验重复3次，结果以¯x±s表示，采用SPSS17.0对数据进行显著性及相关性分析，当P＜0.05时视为差异显著。

2 结果与分析

2.1 等离子体发射功率对AFB1降解率的影响

由图2可知，随着等离子体发射功率的增大，AFB1降解率有不断增大的趋势。这是由于等离子体发生器射频电源的功率增大，所产生等离子体中活性粒子的密度增大，其与溶液中的毒素分子接触的几率也随之增大［20］，毒素降解率越高。

图2 等离子体发射功率对AFB1降解率的影响

2.2 等离子体处理时间对AFB1降解率的影响

由图3可知，500μg／L AFB1经120 W等离子体处理150 s以上，AFB1降解率可达95.0%以上。处理250 s时AFB1的降解率最高达到99.8%。可见，等离子体处理可极有效的降解黄曲霉毒素B1，因此是一种非常有潜力的黄曲霉毒素脱毒方法。

图3 等离子体处理时间对AFB1降解率的影响

2.3 AFB1初始浓度对其降解率的影响

由图4可知，AFB1的初始浓度越低，毒素的降解率越高。200μg／L AFB1经120 W等离子体处理100 s，降解率已达 95.39%，而 1 000μg／L AFB1在相同条件下处理100 s，降解率为80.13%。这可能是当等离子功率一定时，等离子体中产生的活性离子数目基本上是相同的，溶液的初始浓度越低，则溶质分子与活性离子反应的几率越高，反之溶液的初始浓度越高，则溶质分子与活性离子反应的几率就越低［21］。

图4 初始浓度对AFB1降解率的影响

2.4 HPLC-MS／MS法分析AFB1降解产物

2.4.1 等离子体降解AFB1的产物一级质谱图

本研究将500μg／LAFB1进行不同时间的处理，等离子体发射功率设为120 W，对降解后的AFB1进行HPLC-MS／MS分析，图5为等离子处理不同时间的AFB1的质谱图。通过对比不同时间下AFB1的质谱图，分析不同条件下降解产物的异同。

图5 不同降解时间下AFB1的一级质谱图

刘睿杰等［22］运用AFB1降解产物的LC-MS图中物质峰的响应值体现降解产物的含量，从而得出AFB1在乙腈溶液中降解产物的动态形成过程。由图5和图6可知，随着处理时间的增长，物质B、C、D的响应值具有一定的规律性。100 s内物质峰A（AFB1）响应值逐渐降低，B、C的响应值逐渐增加，100 s时B、C响应值开始降低，出现物质峰D，100～150 s内B、C响应值逐渐降低，而D响应值逐渐增加。这表明B、C、D可能是A（AFB1）的降解产物，B、C可能是中间产物。

图6 等离子处理时间对AFB1降解产物响应值的影响

2.4.2 等离子体降解AFB1的质谱信息

为进一步了解降解产物的结构以及降解途径，选取 A（m／z312.9）、B（m／z157.0），C（m／z 299.0），D（m／z339.1）作为母核［23］，碰撞电压为 30 V做二级质谱鉴定。

AFB1结构中的3个主要毒性活性位点见图7，其中呋喃环8、9位双键部位是黄曲霉毒素形成AFB1-DNA、AFB1-pro的作用位点，是导致基因突变致癌致畸的主要功能基团，这点同时解释了黄曲霉毒素家族中AFB1毒性最强的原因；另一活性位点是香豆素内酯环部份，这个位点容易发生水解，因而成为降解活性位点。同时，在AFB1环戊烯酮环上一些取代基团的存在与否也对黄曲霉毒素的毒性有一定的影响。将母离子A（AFB1）与二级质谱碎片信息匹配，找出AFB1中容易断裂的“点”，并与其主要毒性活性位点相结合，为3种降解产物的结构推导提供依据。

图7 AFB1毒性位点

AFB1与3种降解产物的二级质谱信息见表1。根据二级质谱信息，推断的 A（m／z 312.9）、B（m／z 157.0），C（m／z299.0），D（m／z339.1）的可能裂解途径分别见图8～图11。

表1 乙腈中AFB1的主要质谱碎片信息

图8 m／z312.9的二级质谱及碎片信息

图9 m／z157.0的二级质谱及碎片信息

图10 m／z299.0的二级质谱及碎片信息

图11 m／z338.9的二级质谱及碎片信息

根据产物分子量和二级质谱鉴定结果，推断出一种可能的AFB1降解途径，见图12。由图12可知，等离子体降解过程中AFB1部分发生分解断环反应生成产物B、部分在香豆素内酯环部位发生光消去形成产物C。但B、C仅仅是中间产物，两者性质不稳定，随即发生聚合生成较稳定的物质D。产物D结构中，原AFB1呋喃环双键部位的氢原子被醛基取代，原有毒性功能基团被破坏，环戊烯酮环2、3位发生消去反应形成双键，推测产物D的毒性可能发生改变。

图12 AFB1的降解途径

3 结论

等离子体降解 AFB1效果显著，200～500μg／L黄曲霉毒素B1经120 W等离子体处理150 s以上，黄曲霉毒素B1的降解率可达95%以上；随着等离子体功率的增大，AFB1降解率有不断增大的趋势；AFB1溶液初始浓度越低，AFB1降解率越高；通过 HPLCMS／MS分析等离子体处理后的AFB1溶液，结合一级、二级质谱，推断出相对分子质量为156、298、338的3种主要降解产物的结构及等离子体降解黄曲霉毒素B1的可能的降解路径。

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Effect and Pathway Analysis of AflatoxinsB1in Degradation of Acetonitrile-Dissolved by Low Temperature Radio Frequency Plasma

Zhang Yan Wang Anni Xiao Junxia Wang Shiqing Jiang Wenli Li Yupeng
（Qingdao Key Lab of Modern Agricultural Quality and Safety Engineering，Food Science and Engineering College Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）

The effects of radiation duration，plasma transmit power，aflatoxins B1initial concentration on the degradation rate of aflatoxins B1dissolved in acetonitrile by low temperature radio frequency plasma were studied in this paper.Meanwhile，the possible degradation pathway and degradation products were analyzed by HPLC-MS／MS.The results indicated that the aflatoxins B1degradation rate was increased with elevated transmit power and reduced initial aflatoxins B1concentration.When 200～500μg／L aflatoxins B1was exposed to 120 W plasma for more than 150 s，the degradation rate of aflatoxins B1reached more than 95%.HPLC-MS／MSanalysis of the degradation mixture revealed three major quasi-molecular peaks of 157，299，and 339 respectively after comparing first mass information of aflatoxins B1through different plasma treatment time.The three peaks were proposed corresponding to the degradation products of aflatoxins B1.The degradation products and the pathway were identified using secondary mass fragments information and active site in the structure of aflatoxins B1.

low temperature radio frequency plasma，aflatoxins B1，degradation rate，degradation product

X592

A

1003-0174（2015）02-0080-07

国家自然科学基金（31271963）

2013-11-14

张岩，男，1969年出生，副教授，食品安全保藏

王世清，男，1961年出生，教授，食品安全保藏