甲状腺素对HepG2细胞氧化损伤的保护作用

陈立立 ， 唐 雪 ，2， 徐圆媛 ， 余 静 ， 乐国伟 ，2， 施用晖 *，2

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.食品科学与技术国家重点实验室 江南大学，江苏 无锡 214122）

氧化应激是指机体氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。过多自由基会作用于生物大分子，破坏细胞、组织结构，是导致动脉粥样硬化、糖尿病、炎症、衰老、癌症等的发生发展的重要因素[1]。有研究表明，糖尿病患者体内自由基活性增强，各种抗氧化酶如SOD、CAT等活力都降低，GSH、VC、VE等具有抗氧化能力的物质水平也会降低[2]。T3是机体内甲状腺激素的主要生物活性形式[3]。既往临床工作中发现，许多2型糖尿病患者血清FT3水平较正常组显著下降，且随着病龄的延长T3水平降低越显著[4]。肝硬化患者体内血清T3水平与血清MDA水平呈负相关，与GSH和GSHPx水平呈正相关[5]。张洪梅等[6]研究表明，随着甲状腺激素缺乏时间的延长，大鼠脑组织氧化应激状态会发生改变，抗氧化损伤能力不足以代偿活性氧造成的损伤，最后出现脑损伤。另有研究表明，T3预处理可逆转肝脏缺血再灌注损伤引起的GSH、MDA改变，有效保护小鼠肝脏缺血再灌注损伤[7]。且有研究表明，T3可作为促进胰岛β细胞存活和抗其凋亡的保护因子[8]。因此，推测T3可能具有抗氧化保护功能。

核转录相关因子（Nrf2）是重要的转录因子，在氧化应激等情况下与Kelch样ECH联合蛋白质1（Keap1）解离，进入胞质启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因（如NQO1、HO-1）的表达，增加细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性[9]。已有研究表明，T3处理大鼠可导致N-乙酰半胱氨酸预处理的肝脏Nrf2活性的提高[10]。PI3K是Nrf2的上游调节因子，抑制PI3K会阻断Nrf2的核易位及诱导应激蛋白质表达，因此在维持细胞氧化还原状态方面也起到重要作用[11]。

过氧化氢是一种重要的活性氧，其易于获得，性质相对稳定，所以它已成为研究细胞氧化损伤的重要工具[12]。作者以人肝癌细胞（HepG2）为基础，以过氧化氢为氧化应激诱导剂，构建体外氧化应激细胞模型，加入不同浓度的T3处理，从细胞自由基水平、存活率、多种抗氧化酶活及 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1等基因表达水平等多角度，全面分析T3的抗氧化作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2细胞，购自中国科学院上海细胞生物研究所。

1.2 试剂及仪器

DMEM基础培养基，购自Gibco公司；T3，购自Sigma 公司；胰蛋白酶（Trypsin），购自 Amresco 公司；新生小牛血清，购自中国杭州四季青生物技术有限公司；活性氧检测试剂盒、细胞裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、Trizol、RT-PCR相关试剂，均购自碧云天生物技术研究所；T-AOC测试盒、SOD测试盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒，均购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。

多功能酶标仪，Biotek公司制造；CO2细胞培养箱，Thermo公司制造；还有日立7000型荧光分光光度计，Olympus倒置显微镜等。

实验中部分引物用Primerpremier5.0软件设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 细胞培养

将HepG2细胞按5×105个/mL接种在含体积分数10%灭活新生小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中（pH 7.2），37℃、质量分数5%CO2的细胞培养箱中培养。细胞为多角形贴壁生长，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 H2O2诱导HepG2细胞损伤模型的建立

1.4.1 实验分组及药物处理 实验分组：正常对照组，加入常规培养液；H2O2处理2 h组，加入培养液和 H2O2，H2O2终浓度分别为 10、50、100、200 μmol/L；H2O2处理4 h组，加入培养液和H2O2，H2O2终浓度分别为 10、50、100、200 μmol/L。

1.4.2 噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率 取对数生长期HepG2细胞以105个/mL密度接种于96孔板上，每组6孔，于37℃、质量分数5%CO2培养箱中培养，待细胞长至80%左右，去除培养液，加药物处理，每孔100 μL，处理结束后弃上清液，每孔加入100 μL 培养基和 20 μL 5 g/L 的 MTT，温育 4 h，去除培养液及MTT，每孔加入200 μL二甲基亚砜，用酶标仪测定各孔在波长570 nm处的吸光度。

1.4.3 ROS探针法检测细胞自由基水平 取对数生长期HepG2细胞以105个/mL密度接种于96孔的透明底黑板，待细胞增长80%左右，加探针DCFH-DA（事先用无血清的培养基以体积比1∶1 000 稀释）100 μL，30 min 后弃去孔内液体，用PBS洗两遍，加H2O2，处理完后用荧光酶标仪检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm，检测细胞平均荧光强度。

1.5 检测T3对H2O2诱导的HepG2细胞ROS及存活率的影响

实验分组：正常对照组；高中低浓度H2O2处理组；H2O2+T3 组 （T3 浓度为 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，用无血清培养基配制）；阳性对照H2O2+硫辛酸LA组（LA浓度为100 μmol/L）。取对数生长期HepG2细胞以104个/mL密度接种于96孔板，24 h后加T3孵育，24 h后弃上清液，加H2O2处理，检测细胞存活率及ROS水平。

1.6 检测T3对H2O2诱导的HepG2细胞抗氧化物/酶的影响

实验分组：正常对照组，100 μmol/L H2O2处理组，H2O2+高中低T3组，H2O2+LA组。取对数生长期HepG2细胞以 3×105个/mL密度接种于 6孔板，24 h后加T3孵育，48 h后弃上清液，加H2O2处理。处理完后每孔加入300 μL细胞裂解液收集。3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，进行BCA蛋白质测定，然后按试剂盒说明书进行T-AOC、GSHPx、SOD、MDA 的测定。

1.7 RT-PCR法检测目的基因的表达

以1.6方法处理细胞，处理完后每孔加入1 mL Trizol，用氯仿/异丙醇/乙醇法提取细胞内总RNA，并用微量核酸检测仪测定所提取RNA的浓度及纯度。RT-PCR扩增目的片段，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列为：内参β-actin上游引物 5'-TCCCTCAAGATTCTCAGCA-3'，下游引物 5'-ACATCCACAACGCATACA-3'；Nrf2 上游引物 5'-GATGGGTTGGACTGGTGGTGGTT-3'，下游引物 5'-CTCTCGGAGCGGGCGTAGTTTCT-3'；PI3K 上 游 引物5'-TGTACTGGGCCTCATGCACCT-3'，下游引物5'-GGCAAAGCGGCAGTAGTAGAGTAG-3'；NQO1上游引物 5'-GTGGTGGAGTCGGACCTCTATG-3'，下游引物 5'-AAGCCAGAACAGACTCGGCAG-3'；HO-1上游引物5'-ATGACACCAAGGACCAGAG-3'，下游引物 5'-TAAGGACCCATCGGAGAAG-3'。按以下条件进行PCR扩增反应：95℃作用5 min；95℃反应20 s，62℃反应 30 s，72℃反应 20 s；72℃作用2 min。其中第2步到第4步（变性、退火、延伸）设置40个循环。

1.8 数据统计

实验数据经Excel初步处理后，用SPSS 16.0统计软件进行单因子方差分析和邓肯氏多重比较，分析各组间的差异显著性。显著水平为p＜0.05，极显著水平为p＜0.01。数据用垂直条形图和mean±S.D.形式表示。

2 结果分析

2.1 H2O2对HepG2细胞ROS及存活率的影响

10、50、100、200 μmol/L 的 H2O2处理 HepG2 细胞2、4 h后检测细胞存活率及ROS（图1）。

图1 H2O2对HepG2细胞ROS及存活率的影响Fig.1 Effects of H2O2on ROS and cell viability in HepG2

由图1可以观察到，随着H2O2浓度的提高及作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，ROS水平逐渐提高。100μmol/L的H2O2处理HepG2细胞4 h后，细胞存活率为80%左右，ROS提高至300%左右，与正常细胞差异显著 （P＜0.05），提示此浓度可建立HepG2细胞体外氧化应激模型。这与韩飞、Farombi等的实验结果一致[12-13]。

2.2 T3对H2O2诱导的HepG2细胞ROS及存活率的影响

HepG2细胞贴壁生长24 h后，加入不同浓度的T3继续培养48 h后再用H2O2处理，测定细胞存活率及ROS。如图2所示，不同浓度的T3对细胞存活率及 ROS 产生了不同影响。10-9、10-7、10-5mol/L 的T3 可分别显著提高 50、100、200 μmol/L H2O2氧化损伤的细胞的存活率，降低细胞 ROS（P＜0.05），但10-5mol/L的T3反而降低50 μmol/L H2O2氧化损伤的细胞的存活率，增加细胞ROS。最佳作用剂量的T3效果与100 μmol/L LA效果相当。

图2 T3对H2O2诱导的HepG2细胞ROS及存活率的影响Fig.2 Effects of T3 on ROS and cell viability of H2O2 reduced HepG2 cells

2.3 T3对H2O2诱导的HepG2细胞抗氧化酶的影响

见表1。与对照组相比，100 μmol/L H2O2组细胞内T-AOC、SOD及GSH-Px活性均显著降低，MDA 含量显著提高 （P＜0.05）。 加入 10-5、10-7、10-9mol/L的T3可不同程度地提高细胞T-AOC、SOD及GSH-Px活性，降低MDA含量。其中10-7mol/L T3处理组与H2O2组细胞差异最显著（P＜0.01）。 结果表明，T3对氧化损伤的HepG2细胞的氧化还原状态起到了明显的改善作用，且T3作用效果与使用剂量相关。

2.4 T3对H2O2诱导的HepG2细胞抗氧化相关基因的影响

见表2。与对照组相比，100 μmol/L H2O2组细胞内 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表达均显著降低，加入T3可不同程度地提高细胞这些基因的表达。其中10-7mol/L T3对PI3K、Nrf2、NQO1的表达提高作用最显著 （P＜0.01），10-9mol/L T3 对 HO-1 的表达提高作用最显著（P＜0.01）。结果表明，T3对氧化损伤的HepG2细胞的抗氧化关键基因的表达有影响，且与剂量有关。

表1 T3对H2O2诱导的HepG2细胞 T-AOC、SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响（x±s，n=3）Table 1 Effect of T3 on T-AOC，SOD，GSH-Px activities and MDA content in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

表2 T3 对 H2O2诱导的 HepG2 细胞 PI3K、Nrf2、NQO1、HO-1 表达的影响（x±s，n=3）Table 2 Effect of T3 on the expression of PI3K，Nrf2，NQO1 and HO-1 in H2O2reduced HepG2 cell（x±s，n=3）

3 讨论

氧化应激是体内氧化和抗氧化水平失去平衡的后果，过量的活性氧会引起分子、细胞和机体的损伤[14]。大量研究表明[15]，氧化应激是代谢综合征发生和发展的重要病因之一。甲状腺激素参与机体的正常代谢，与组织器官的氧化和抗氧化状态有着重要关系。

通过体外建立HepG2细胞H2O2氧化损伤模型，初步研究了T3对氧化损伤细胞存活率、ROS水平、抗氧化酶活性及相关基因表达的影响。结果显示，10、50、100、200 μmol/L H2O2可显著提高胞内ROS水平，降低细胞存活率，表明HepG2细胞的ROS水平和存活率与H2O2作用浓度存在剂量效应。为了更好地探究T3作用剂量与细胞损伤程度之间的关系，选择低中高3个H2O2浓度。比较发现，对 50、100、200 μmol/L H2O2处理的 HepG2 细胞，T3抗氧化保护作用存在差异。 10-9、10-7、10-5mol/L T3可分别显著降低 50、100、200 μmol/L H2O2处理的细胞的 ROS水平，增加细胞存活率（p＜0.05），表明T3最佳作用剂量与细胞氧化损伤程度有关。有研究表明，补充外源性甲状腺激素对外科重症时的器官有保护作用，这已在心、肺、器官移植中得到初步证实[16]。虽然甲状腺激素的器官保护作用的机制尚不清楚，但已有研究显示可能与甲状腺激素可以抑制细胞凋亡等有关[17]。因此，T3对H2O2氧化损伤的HepG2细胞有保护作用可能与T3能抑制HepG2细胞凋亡和清除ROS有关。近年来越来越多证据表明，VA、VC、VE、异黄酮、硫辛酸等被用作抗氧化的物质，在低剂量使用条件下表现抗氧化作用，而在高剂量作用下却表现促氧化作用[18]。本实验结果中也有类似发现，10-5mol/L T3反而增加 50 μmol/L H2O2处理的细胞的ROS水平，降低细胞存活率，说明在低程度损伤时，细胞有自行调节氧化还原状态的能力，而高浓度T3会通过增加细胞代谢而产生更多自由基，从而损害细胞；而随着损伤加重，T3逐渐显现抗氧化作用，且损伤程度越严重，T3所需浓度越大。

为了进一步探究T3抗氧化保护作用的可能机制，作者检测了胞内T-AOC、GSH-Px及SOD活性和MDA含量及一些抗氧化相关基因表达。结果显示，与对照组相比，100 μmol/L H2O2组细胞内TAOC、GSH-Px及SOD活性显著降低，MDA含量显著升高（p＜0.05），说明细胞内氧化还原平衡被打破，造成细胞内氧化应激。加入T3可显著降低细胞MDA含量，提高T-AOC、GSH-Px及SOD活性，其中10-7mol/L T3作用效果最显著，这与自由基及存活率结果一致。核转录相关因子（Nrf2）是重要的转录因子，在氧化应激时被激活，由胞质转移到核内启动Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表达，增加细胞对氧化应激的抗性[19]。研究发现，T3添加1 h和2 h后，细胞核内诱导产生的Nrf2水平显著提高，胞质内Nrf2水平减少，即T3处理会诱导大鼠肝细胞Nrf2活化。

4 结语

本研究结果显示，加入T3可显著提高细胞Nrf2的表达，同时，Nrf2的上游调控因子PI3K及下游Ⅱ相酶基因NQO1及HO-1的表达均显著提高。但是本实验测定的是细胞总的Nrf2的表达，下一步可以将T3处理的细胞进行核质分离，分别测定Nrf2水平的变化。

本实验结果表明，T3可通过提高PI3K的表达从而提高Nrf2的表达，继而提高下游Ⅱ相酶基因的表达，进而提高细胞内SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性，降低MDA生成，从而降低细胞自由基水平，提高细胞存活率，进而发挥抗氧化保护作用。但过高浓度T3反而可能因刺激细胞代谢增强，产生过多自由基而起促进氧化的作用。

[1]吴其夏，余应年，卢建.病理生理学[M].北京：中国协和医科大学出版社，2003.

[2]Palanisamy P，Govindasamy B，Ganesan S，et al.Evaluation of oxidative stress and antioxidant status in patients with diabetes mellitus[J].Journal of Applied Sciences Research，2009，5（7）：770-775.

[3]Yen P M.Physiological and molecular basis of thyroid hormone action[J].Physiological Reviews，2001，81（3）：1097-1142.

[4]张秀华，郗光霞，魏正俐，等.甲状腺激素及促甲状腺素在2型糖尿病中的变化[J].山西医科大学学报，2011，42（2）：130-131.ZHANG Xiuhua，XI Guangxia，WEI Zhengli，et al.Changes in thyroid hormone and thyrotropin in type 2 diabetes[J].Journal of Shanxi Medical University，2011，42（2）：130-131.（in Chinese）

[5]Abdel H A M，Ehab M M A，Tarek M M，et al.Oxidative stress and thyroid hormones in patients with liver diseases[J].European Journal of Internal Medicine，2009，20：703-708.

[6]张洪梅，苏青，罗敏.甲状腺激素缺乏对不同发育时期大鼠脑组织氧化应激指标的影响[J].吉林大学学报，2010，36（5）：854-857.ZHANG Hongmei，SU Qing，LUO Min.Effect of thyroid hormone deficiency on oxidative stress parameters in different developing stages of rat brain[J].Journal of Jilin University，2010，36（5）：854-857.（in Chinese）

[7]刘平果，李敏，王效民，等.甲状腺素预处理对Pringle法诱导小鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华肝胆外科杂志，2011，17（7）：592-593.LIU Pingguo，LI Min，WANG Xiaomin，et al.Thyroid hormone preconditioning protects from Pringle manoeuvere of ischemia reperfusion induced liver injury[J].Chinese Journal of Hepatobiliary Surgery，2011，17（7）：592-593.（in Chinese）

[8]Falzacappa C V，Mangialardo C，Madaro L，et al.Thyroid hormone T3 counteracts STZ induced diabetes in mouse[J].PloS One，2011，6（5）：19839.

[9]Nguyen T，Nioi P，Cecil B P.The Nrf2 antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress[J].Biol Chem，2009，284（20）：13291-13295.

[10]Romanque P，Cornejo P，Valdés S，et al.Thyroid hormone administration induces rat liver Nrf2 activation：Suppression by NAcetylcysteine pretreatment[J].Thyroid，2011，21（6）：655-662.

[11]Nakaso K，Yano H.PI3K is a key molecule in the Nrf2-mediated regulation of antioxidative proteins by hemin in human neuroblastoma cells[J].FEBS Letters，2003，546：181-184.

[12]韩飞，周孟良.过氧化氢诱导HepG2细胞产生氧化应激细胞模型的建立[J].食品科学，2011，32（5）：55-57.HAN Fei，ZHOU Mengliang.An Experimental HepG2 cell model of hydrogen peroxide induced DNA oxidative injury[J].Food Science，2011，32（5）：55-57.（in Chinese）

[13]Farombi E O，Moller P，Dragsted L O.Ex-vivo and in vitro protective effects of kolaviron against oxygen-derived radical-induced DNA damage and oxidative stress in human lymphocyles and rat liver cells[J].Cell Biol Toxicol，2004，20：1-12.

[14]Hirooka Y，Sagara Y，Kishi T，et al.Oxidative stress and central cardiovascular regulation[J].Circ J，2010，74（5）：827-835.

[15]Hopps E，Noto D，Caimi G，et al.A novel component of the metabolic syndrome：the oxidative stress[J].Nutr Metab Cardiovasc Dis，2009，20（1）：72-77.

[16]六继海，杨连粤.甲状腺激素对脏器功能保护作用机制的研究进展[J].中国实用外科杂志，2001，21（6）：272-276.LIU Jihai，YANG Lianyue.Advance and development of research of protective mechanism of organ function by thyroxin[J].Chinese Journal of Practical Surgery，2001，21（6）：272-276.（in Chinese）

[17]Schneider J J，Hood D A.Effect of thyroid hormone on mtHsp70 expression，mitochondrial import and processing in cardiac muscle[J].Journal of endocrinology，2000，165（1）：9-17.

[18]黄更文，杨恋月，刘继海，等.一些抗氧化剂的抗/促氧化作用及其机制[J].动物营养学报，2012，24（4）：595-605.HUANG Gengwen，YANG Lianyue，LIU Jihai，et al.Effects of exogenous thyroid hormone on intestinal barrier in sepsis[J].Chinese Journal of General Surgery，2012，24（4）：595-605.（in Chinese）

[19]王豫萍，程明亮.Nrf2-Keap1抗氧化系统与肝脏疾病[J].世界华人消化杂志，2010，18（18）：1907-1911.WANG Yuping，CHENG Mingliang.Nrf2-Keap1 antioxidant system and hepatic diseases[J].World Chinese Journal of Digestology，2010，18（18）：1907-1911.（in Chinese）