刺槐豆多糖纳米硒的制备及表征

高义霞， 周向军， 袁毅君， 鲜鹏杰

（天水师范学院 生命科学与化学学院，甘肃 天水 741001）

硒是人体生命中必需的重要微量元素，具有增强机体免疫能力、抵抗自由基损伤、防病和调节甲状腺机能等多种功能[1-3]。然而硒及其化合物对人体有效和中毒剂量范围非常窄[4]，因此需通过有机硒化物或纳米硒的形式来降低其毒性。纳米硒生物吸收性高，能高效清除自由基[5-6]，且毒性比无机硒和天然有机硒低，活性比无机硒和天然有机硒高，从而克服了无机硒有效与中毒剂量十分接近而难以预防的缺点[7-9]，是一种有效的补硒药物。纳米硒的合成方法有抗坏血酸还原法、表面活性剂法、微乳液法、蛋白质模板法、聚合物模板法、超声化学法、温度控制法和电化学法[10-11]等。抗坏血酸（VC）将亚硒酸（H2SeO3）中的 Se（IV）还原为 Se0后，此时硒不稳定，极易团聚，如聚合体一旦超过纳米尺度，其生物活性大大降低，因此需要对纳米硒粒子表面进行修饰以防止聚集。刺槐豆多糖是刺槐种子胚乳部分焙炒后热水抽提而成，常用于食品增稠剂、持水剂等，主要含有甘露糖和半乳糖[12]，但因相对分子质量大、黏度高、溶解度低等限制了其临床应用[13]。研究发现，壳聚糖、阿拉伯胶等多糖可作为模板用于合成纳米硒[14]，且单质硒微粒的形成和聚集易受到糖分子的调控[15]。因此在发生氧化还原反应前加入刺槐豆多糖，其便吸附、包裹在初始形成的硒晶体表面，一方面阻止了粒子之间相互结合、团聚，使纳米硒稳定存在于溶液中，另一方面可减缓或控制粒子的生长，使产生的纳米硒形成多种形貌。本研究中以刺槐豆多糖为软模板制备纳米硒，生成的纳米硒具有良好的生物活性和广泛用途，有效地提高了硒的生理功能。

1 实验器材

1.1 材料及试剂

刺槐豆胶（食品级，分子质量为300 ku，黏度3 700 mPa·s，主要含有甘露糖及半乳糖），甘肃弘诺科技贸易有限公司产品。抗坏血酸，Sigma公司产品。Savege液：氯仿与正丁醇以4∶1的体积比混合。亚硒酸等其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

722型可见分光光度计，上海欣茂仪器有限公司制造；UV-2450型紫外光谱仪，日本岛津公司制造；RE-2000B旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂制造；D2F-6021型真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司制造；TGL-20M高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司制造；JSM-6701F冷场发射型扫描电镜，日本电子光学中心制造。

2 实验方法

2.1 刺槐豆多糖的制备

参照高义霞方法[16]进行。

2.2 纳米硒的制备

取一定量的亚硒酸、刺槐豆多糖溶液置于25 mL的比色管中，混合均匀后静置片刻，加入一定量抗坏血酸溶液，加水稀释至刻度，振摇混合均匀，将反应混合液置于不同温度水浴中或超声波环境中一定时间，使H2SeO3中Se4+还原为Se0，并在刺槐豆多糖模板上生长至一定的形貌[17]。

2.3 表征手段

利用紫外光谱法表征刺槐豆多糖为软模板的纳米硒溶液的粒度变化；扫描电镜（SEM）和X射线衍射（XRD）分别测定最佳制备纳米硒工艺条件下反应产物的形貌、粒度大小及形态。

3 结果与分析

3.1 紫外光谱

图1是不同溶液的全扫描吸收光谱，作为制备纳米硒的反应背景，可知VC最大吸收峰在265 nm处，刺槐豆多糖在此处无吸收峰。单纯刺槐豆多糖、VC或两者的混合液在大于400 nm的可见光区均无吸收，说明在该条件下无红色纳米硒生成。以刺槐豆多糖为介质的总反应体系中，在400～600 nm处有较强的吸收，峰值较宽，说明该条件下生成了大量的红色纳米硒，但溶液中含有未消耗的反应物及中间产物，此结果与SEM表征结果 （见图2）一致。

图1 不同溶液的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of different solutions

图2 H2SeO3、刺槐豆多糖和VC混合物的SEM分析Fig.2 SEM analysis mixture of H2SeO3，locust bean polysaccharides and VC

据测定胶体溶液的双波长法[18]，胶体粒径参数

式（1）中， A1、 A2分别为波长 λ1、 λ2处的吸光值。

固定波长λ1、λ2，当吸光值比值A2/A1不变时胶体粒径不变，生成的纳米硒粒径均匀，处于稳定状态。为避开VC的吸收且使测定方便，试验选择410nm和490 nm作为纳米硒测定波长，并以A410/A490作为表征纳米硒粒度随时间变化的依据[19]。

3.2 反应物浓度对纳米硒的影响

固定 H2SeO3浓度为 0.1 mmol/L，VC浓度为0.1 mmol/L，改变刺槐豆多糖质量分数，40℃反应4 h，考察其对纳米硒的影响，结果见图3（a）。随刺槐豆多糖质量分数的增加，吸光值呈明显增大趋势，当刺槐豆多糖质量分数为0.1‰时，吸光值基本保持不变，但A410/A490开始降低；当刺槐豆多糖质量分数为0.2‰时，A410/A490维持在1.7左右，说明此时纳米硒颗粒稳定，故刺槐豆多糖质量分数选择0.2‰。固定H2SeO3浓度为0.01 mmol/L，刺槐豆多糖质量分数为0.2‰，改变VC浓度，40℃反应4 h，考察其对纳米硒形成的影响，结果见图3（b）。随着VC浓度的增加，吸光值逐渐增大，当VC浓度为0.05 mmol/L时，吸光值最大且趋于平稳，但此时A410/A490为1.68，且持续增加；当VC浓度为0.1 mmol/L，A410/A490稳定在1.77，说明此时纳米硒粒度均匀稳定，因此选择 VC 浓度为 0.05～0.1 mmol/L。 理论上按 n（VC）/n（H2SeO3）=2∶1 计量关系发生氧化还原反应，但稍过量的VC能提供还原性介质，使晶核生长速度加快，同时起稳定纳米硒的作用[20-21]。 n（VC）/n（H2SeO3）=5∶1～10∶1 为宜，本试验则选择 5∶1。

图3 刺槐豆多糖质量分数及VC浓度对纳米硒的影响Fig.3 Effects of locust bean polysaccharides and VC concentration on nano-selenium

3.3 不同温度下反应时间对纳米硒的影响

固定H2SeO3浓度为0.01 mmol/L，刺槐豆多糖质量分数为0.2‰，VC浓度为0.05 mmol/L，考察20、40、60℃和80℃下不同时间对纳米硒的影响，结果见图4。 由图 4（a）和（b）可知，随反应时间的延长，两者反应物吸光值不断增加，2 h后均趋于稳定，A410/A490分别维持在1.76和1.8左右，说明此时纳米硒稳定；和20℃相比，40℃生成物吸光值更高，说明该条件下反应较为迅速充分。由图4（c）可知，60℃条件下，反应混合物吸光值随时间的增加而明显增大，5 h后吸光值增加程度减缓，但反应4 h后，A410/A490下降明显，说明此时纳米硒稳定程度开始降低。由图4（d）可知，80℃条件下，吸光值随时间的延长呈急剧增加趋势，4 h后逐步趋于平稳，但A410/A490一直明显降低，说明该条件下形成的纳米硒有增大、团聚趋势[22]，不适合本试验。试验中发现，在较高温度下，随着时间的延长，溶液颜色加深，说明纳米硒颗粒随温度升高有定向生长趋势，形成了其它形貌[23-24]。综合考虑40℃和60℃吸光值及A410/A490，从节省能源等因素综合考虑，选择40℃反应4 h作为纳米硒制备条件。

图4 不同温度下反应时间对纳米硒的影响Fig.4 Effects of reaction time on nano-selenium under different temperature

3.4 扫描电镜表征

在上述筛选出的条件，即刺槐豆多糖质量分数为 0.2‰，n（VC）/n（H2SeO3）为 5∶1，40 ℃反应 4 h，制备的反应产物经离心后在室温条件下放置一个月仍为红色，溶液中无沉淀，进行SEM分析，结果见图5，可知此条件下制备的纳米硒为球状分子，粒径约在95～100 nm，颗粒粒度大小均一、分散均匀。

3.5 X射线衍射分析

以质量分数0.2‰刺槐豆多糖为分散体系，VC和 H2SeO2（两者摩尔比 5∶1）40 ℃水浴反应 4 h，制得纳米硒刺槐豆多糖分散乳液，冷冻离心、旋转蒸发得纳米硒溶液，-20℃冷冻干燥至恒质量，取固体粉末进行X射线衍射分析，并与刺槐豆多糖衍射图比较。

图5 最佳条件下反应产物的SEM分析Fig.5 SEM analysis of Reaction product under the optimal conditions

图6为1和2两个样品在2°≤2θ≤85°范围内的XRD分析图。

图6 反应产物和刺槐豆多糖的XRD分析Fig.6 XRD analysis of Reaction product and Locust bean polysaccharides

结果表明：样品2有X衍射峰，说明刺槐豆多糖是杂多糖，如糖蛋白质，因为均多糖不能形成晶体，为无定型粉末；由图与样品1的衍射峰对比可知，两种物质峰形及位置相同，说明样品1中没有结晶态物质，即以刺槐豆多糖为模板生成的纳米硒非晶态亦为无定型粉末。

4 结语

通过控制实验条件，以刺槐豆多糖为模板，用抗坏血酸还原亚硒酸的方法制备纳米硒。当抗坏血酸和亚硒酸摩尔比为5∶1，刺槐豆多糖质量分数为0.2‰，40℃反应4 h后可得红色均匀的纳米硒颗粒，其粒度大多在95～100 nm，分散相对均匀，X衍射显示其为非晶态无定型粉末。纳米硒具有硒和刺槐豆多糖的双重功效，有望在营养和疾病防治方面获得进一步应用。

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