福建地区口腔癌患者p53基因72密码子多态性与口腔癌易感性的研究

何保昌，陈 法，刘芳萍，柳迪萌，陈 珍，蔡 琳

吸烟、饮酒是口腔癌的主要危险因素，但暴露于同样环境因素中的人发生口腔癌的仅是一部分，这提示遗传因素所决定的个体易感性在口腔癌演变过程中扮演着不可忽视的角色。Jing等在中国汉族人群中研究发现，p53第4外显子72密码子多态性与口腔癌有关，特别是携带Pro等位基因可增加患口腔癌的风险[1]。但Saini和Jiang等的研究并未发现p53第4外显子72密码子多态性与口腔癌有关[2－3]。近年来，p53基因第4外显子72密码子多态性与口腔癌的关系也受到广大学者的研究，但结论尚存在争议。鉴于此，本研究探讨p53基因第4外显子72密码子多态性与口腔癌易感性的关系，并分析其与环境因素在口腔癌发生中的交互作用，力求更全面地探讨p53基因多态性、环境因素与口腔癌的关联，为口腔癌的预防和控制提供分子水平的依据，以提高口腔癌的三级预防水平。

1 对象与方法

1.1 对象 采用病例对照研究设计，病例组149例，为2010年9月－2014年1月在福建医科大学附属第一医院口腔颌面外科住院并经病理确诊的口腔癌新发病例；对照组303例，为同期进行健康体检的人群、其他科室的住院患者以及社区人群。病例组与对照组一般人口学特征的比较分析见表1。2组在性别、年龄、民族、婚姻状况方面均衡可比（P＞0.05），但在职业、文化程度、居住地等方面的分布差别有统计学意义。与对照组比较，病例组吸烟、饮酒、不良修复体等所占比例较大，差别均有统计学意义（P＜0.05）；但在饮茶、肿瘤家族史方面差别无统计学意义（P＞0.05）。本研究经过福建医科大学伦理委员会批准，研究对象均签署了知情同意书。

1.2 问卷调查及标本采集 采用统一编制的调查表，由经过统一培训的调查员进行面对面调查获得研究对象的一般人口学特征、吸烟、饮酒以及饮茶等相关信息。饮酒指每周至少1次，持续半年以上者[4]；吸烟定义为累计吸烟100支以上者[5]；饮茶定义为每周至少1杯，持续半年以上[6]。病例对照人群采集抗凝血样标本，离心分离出白细胞，用裂解法提取DNA，用于p53基因型检测。

1.3 基因检测 引物序列由国际癌症中心（IARC）提供，上海生工公司合成。

扩增目的片段413bp。PCR反应体系总量50μL，包括PCRmix 14.5μL、上下游引物各2.0μL、模板DNA 2.0μL，灭菌水加至50μL。扩增参数：94℃预变性2min→94℃变性30s→60℃退火45s→72℃延伸120s，于PCR仪（480，美国PE公司）循环50次，72℃延伸10min。酶切反应体系总量25μL，PCR产物10μL、10×Buffer反应缓冲液2.5μL、Bst UI酶1.0μL，37℃消化过夜。酶切后产物点样于2.0%琼脂糖凝胶中（凝胶中含5mg／mL的溴化乙锭），100V电泳45min，电泳液为1×TAE。停止电泳后，在凝胶成像系统中观察结果并照相，Pro／Pro型可在413bp处出现1条带，Arg／Arg型可在253和160bp处出现2条带，Pro／Arg型可在160、253和413bp处出现3条带。

1.4 统计学处理 采用χ2检验对研究对象的一般人口学特征进行均衡性检验，运用Hardy－Weinberg遗传平衡定律判断对照群体代表性；采用非条件Logistic回归模型计算SNP位点与口腔癌关系的比值比（odds ratio，OR）、95%可信区间（95%confidence interval，95%CI）及其相乘交互作用。利用叉生分析和Rothman提出的超额相对危险度（RERI）、归因比（AP）和交互作用指数（S）进行相加交互作用分析[7]。以上分析均由Stata 12.1软件包完成，所有P值均为双侧检验结果，检验水准α为0.05。

表1 病例组与对照组的人口学特征比较Tab 1 The comparison of demographic data of cases and controls

2 结 果

2.1 p53基因第4外显子72密码子多态性检测结果 先对p53基因第4外显子进行PCR扩增，扩增产物阳性的再做限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP），在413bp处扩增出目的片段，PCR扩增结果见图1。p53基因第4外显子经内切酶Bst UI酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，呈现3种不同的电泳条带（即3种不同的基因型），酶切结果见图2。纯合子Pro／Pro基因型因基因突变使酶切位点丢失，在413bp处出现1条带，野生型纯合子Arg／Arg基因型可在253和160bp处出现2条带，杂合子Pro／Arg基因型在160、253和413bp出现3个片段。

图1 p53基因第4外显子PCR结果Fig 1 The result of p53gene exon4PCR

图2 p53基因第4外显子72密码子多态性酶切结果Fig 2 The result of p53gene polymorphism restriction map on exon4condon 72

2.2 Hardy－Weinberg平衡检验及基因位点遗传模型分析 p53基因第4外显子72密码子在病例组和对照组中的基因型频率分布进行Hardy－Weinberg遗传平衡度检验（表2），结果显示各基因型的分布频率符合 Hardy－Weinberg遗传平衡（P＞0.05），说明对照人群具有代表性。

表2 p53基因72密码子多态性的Hardy－Weinberg检验结果Tab 2 The result of p53gene codon 72polymorphism Hardy－Weinberg test

2.3 p53基因72密码子多态性与口腔癌易感性的研究 与对照组相比，病例组p53基因携带Pro／Pro基因型是发生口腔癌的遗传易感因素；经性别、年龄、职业、民族、教育程度、体质量指数、居住地、婚姻状况、肿瘤家族史调整后，结果仍然一致，与Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Arg／Pro基因型相比，p53基因携带Pro／Pro基因型的OR值分别为1.837（1.016，3.325）、2.189（1.389，3.449）。结果见表3。

表3 p53基因72密码子多态性与口腔癌易感性的研究Tab 3 Study on the susceptibility of p53gene codon 72polymorphism and oral cancer

2.4 p53基因72密码子多态性与环境因素的交互作用 与携带Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未吸烟者相比，携带Pro／Pro基因型的未吸烟者和吸烟者患口腔癌的风险均显著增加，其OR值及95%CI分别为 2.286（1.352，3.865）和 7.672（3.567，16.503）。但并未发现p53基因携带Pro等位基因与吸烟存在相乘及相加交互作用。

与携带Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未饮酒者相比，携带Pro／Pro基因型的饮酒者患口腔癌风险增 加 更 为 显 著 （OR：11.406，95%CI：4.740，27.444）。而且p53基因携带Pro等位基因与饮酒之间存在显著的相乘交互作用（OR相乘：4.375，95%CI：1.646，11.627），但并未发现它们之间存在相加交互作用。

与携带Arg／Arg＋Arg／Pro基因型的未饮茶者相比，携带Pro／Pro基因型的饮茶者患口腔癌风险增加3.108倍（1.587，5.739），但并未发现p53基因携带Pro等位基因与饮茶之间存在显著的相乘及相加交互作用（表4）。

3 讨 论

3.1 Hardy－Weinberg遗传平衡 目前认为在分析基因多态性与疾病的关联时，要求对照基因型需符合Hardy－Weinberg遗传平衡定律，用以说明研究的人群选择来自随机婚配的群体，且样本量足够大。本次研究对照人群的p53基因第4外显子72密码子的多态性基因位点符合Hardy－Weinberg遗传平衡，可以认为本次研究对照人群具有人群代表性。

3.2 p53基因第4外显子72密码子的多态性与口腔癌易感性的关系 在肿瘤发生过程中，抑癌基因的失活和变异起着重要的作用。p53基因作为与人类肿瘤关系最为密切的抑癌基因而受到广泛关注，其定位于人类染色体17p13.1，有11个外显子和10个内含子。p53基因第4外显子72密码子由于使G颠换成C而产生2个不同的等位基因Arg和Pro，这种p53基因72密码子多态性会引起p53基因编码蛋白功能发生改变，而P53蛋白是重要肿瘤抑制剂，发挥着基因卫士的功能，主要参与启动细胞周期监控、触发细胞凋亡、促进受损的DNA修复。因此P53蛋白的功能发生改变后，便会引起机体对一些肿瘤的基因易感性[8－9]。

有实验表明，p53第4外显子72密码子2种基因编码的P53Pro蛋白和P53Arg蛋白均为野生型，但两者的生物学功能则不完全相同，主要表现在转录激活作用、抑制转化细胞生长和诱导细胞凋亡能力等方面[10]。生物学功能的差异可能是P53Arg和P53Pro通过不同途径选择性地调节细胞特定功能的结果。

p53第4外显子72密码子多态性的Arg／Arg、Pro／Arg、Pro／Pro 3种基因型在病例组的分布频率分别为20.13%、44.30%、35.57%，在对照组的分布频率分别为23.10%、55.12%、21.78%，野生型Arg／Arg基因在2组分布频率差别不大。与Arg／Arg基因型及 Arg／Arg＋Pro／Pro基因型相比，携带Pro／Pro基因型使口腔癌发病风险分别增加1.837倍和2.189倍，表明人群携带Pro／Pro基因型可能是口腔癌的危险因素，这与Jing等的研究结果一致[1]。原因可能是P53Pro对细胞凋亡的诱导作用及对细胞损伤的修复功能较P53Arg强所致，从而使机体在致癌因素的作用下易发生细胞的异常增生，导致肿瘤[11]。有研究发现，Pro／Pro通过Fas／FasL途径调节头颈部肿瘤的细胞凋亡[12]，因P53Arg型头颈部鳞癌患者缺乏Fas和FasL的共表达，而且抗凋亡蛋白Bcl－2高表达，从而减弱P53Arg诱导细胞凋亡能力[13]。但Bau等研究发现，p53基因72密码子的Arg／Arg基因与口腔癌的发生有关，与携带Pro／Pro基因型相比，携带Arg／Arg基因型可增加2.68倍患口腔癌的风险（1.19，6.01）[14]。Drummond等研究表明，p53第4外显子72密码子多态性与口腔癌无关[15]。研究结果不一致可能与p53基因多态性的分布受种族、地区、样本量大小、研究对象的选择、检测方法等因素的影响，也可能受到其他混杂因素的干扰。p53第4外显子72密码子多态性与口腔癌易感性的关系有待进一步深入研究进行验证。

3.3 p53第4外显子72密码子多态性与环境因素的交互作用 众所周知，肿瘤的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。随着现代科学技术的不断发展，人们对肿瘤病因学研究已经从单纯的危险因素分析过渡到揭示暴露因子与遗传特征的联合作用。随着人们生活水平的提高，吸烟、饮酒、饮茶等生活习惯已经成为多数人日常生活中不可或缺的一部分，生活方式与基因多态性之间的交互作用值得关注。

本研究结果显示，p53第4外显子72密码子多态性与饮酒之间存在相乘交互作用。携带Pro等位基因的饮酒者与携带Arg／Arg＋Arg／Pro基因的不饮酒者相比，口腔癌的风险提高11.406倍。这表明Pro基因型可调节饮酒的致癌作用，如果两个因素同时暴露，使患口腔癌的危险性增加。本结果与Ihsan等研究结果一致[16]。饮酒是口腔癌重要危险因素之一，酒中可能包含一些致癌物质或产生一些致癌物，或可阻碍致癌物的降解，在致癌过程中，由于P53Pro等位基因的存在，使p53抑癌功能发生变化，细胞恶性生长，导致患口腔癌危险性升高。但本次研究未发现它们之间存在相加交互作用。

此外，P53Pro等位基因与吸烟之间的相乘交互作用虽然没有统计学意义，但研究中发现，与携带Arg／Arg基因的不吸烟者相比，携带Pro／Pro基因型的吸烟者患口腔癌的OR值为7.672（3.567，16.503），提示P53Pro等位基因在一定程度上调节并增强吸烟的致癌作用。有研究显示，重度吸烟者的口腔黏膜细胞DNA损伤明显高于非吸烟者，头颈部鳞癌患者p53基因过度表达和缺失与患者吸烟有关，烟草中的致癌物会诱发p53基因发生的突变和失活[17]。目前p53基因多态性与吸烟的交互作用在口腔癌中研究还很少，但p53多态性与吸烟的交互作用在其他癌症研究中均有交互作用的报道，如p53基因型与肝癌的研究已有报道，携带Pro等位基因可提高乙肝病毒携带者患肝癌的危险性[18]；又如一些对肺癌的研究则表明，Pro等位基因可提高吸烟者患肺癌的危险性[19－20]；还有在前列腺癌的相关研究中也提示，Pro等位基因可提高吸烟者患癌的危险性[21]。因此，p53基因多态性所决定的遗传易感性可调节在吸烟暴露下对不同癌症发病的影响。P53Pro等位基因与吸烟联合作用，在一定程度上可导致口腔癌发病风险增加。

综上所述，p53基因Pro／Pro基因型可能是福建地区口腔癌的易感基因，饮酒与p53第4外显子72密码子多态性位点之间有相乘交互作用。遗传因素无法改变，因此，提倡健康的生活方式对预防口腔癌有重要的意义。本次研究仅针对福建地区的人群，还需要扩大样本量和地区范围开展更深入的研究，进一步探讨遗传因素与生活方式在口腔癌发生发展中的相互作用。

（致谢：衷心感谢福建医科大学附属第一医院口腔颌面外科林李嵩主任、林耿冰副主任医师、饶振雄医师、廖云阳医师、郑晓燕护士在现场流行病学调查中的大力支持，感谢福建医科大学公共卫生学院黄江峰、叶珍妹、叶贵华、叶佳增在实验过程中的辛勤付出。）

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