牙龈卟啉单胞菌促进动脉粥样硬化的机制研究

潘盛波，雷 浪，李厚轩，闫福华

2.南京大学医学院 附属口腔医院，南京 210008

牙周感染与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）密切相关。流行病学研究和动物实验均显示，牙周感染能够加速AS的形成[1－2]。牙周炎进展过程中，细菌及其代谢产物可以进入血液，形成低水平的菌血症和内毒素血症。在血管壁中，宿主防御系统可能利用 Toll样受体（toll like receptors，TLRs）等模式识别受体，识别侵入的牙周致病菌及其代谢产物，激活多种促炎转录因子的激活，产生先天免疫反应，导致组织局部炎症反应发生[3]。目前，AS被认为是一种炎症性疾病，AS血管局部肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、单核细胞趋化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）、白细胞介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）等炎症因子表达上调，血管局部表现为炎症反应[4－5]。牙龈卟啉 单 胞 菌 （Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis）能够刺激主动脉内皮细胞、脐静脉内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞促炎细胞因子的表达[6]。载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E－deficient，ApoE－／－）小鼠由于脂质代谢障碍，在普通饮食下即可形成高脂血症，是建立AS理想的动物模型[7]。本研究拟进一步分析TLR通路在P.gingivalis菌血症促进ApoE－／－小鼠AS进展过程中的作用，进一步揭示牙周病和心血管疾病间的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料P.gingivalis33277（美国 ATCC公司）；脑心浸出液（brain heart infusion，BHI）、酵母提取物（英国Oxoid公司）；苏丹Ⅳ染料（美国Sigma公司）；TNF－α、MCP－1和IL－1β酶联免疫吸附实验（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（美国eBioscience公司）；TNF－α和 MCP－1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；免疫组织化学试剂盒（中国迈新生物技术开发有限公司）；核因子－κB（nuclear factor－κB，NF－κB）、TLR－2、TLR－4 和GAPDH多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、HRP标记二抗、ECL化学发光试剂盒（中国碧云天生物技术有限公司）；脱脂奶粉（美国BD公司）；凝胶电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）试剂盒、细胞核和细胞质蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、生物素3′末端DNA标记试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养P.gingivalis在含 37g／L BHI、5g／L 酵 母 提 取 物、5mg／L 氯 化 血 红 素 和0.2mg／L甲萘醌的培养基中厌氧条件下培养。

1.2.2 动物饲养 6周龄 ApoE－／－小鼠（18只）[北京大学医学部动物中心，许可证号SCXK（京）2011－0012]，在无特异致病菌、恒温、恒湿、12h光照和12h黑暗以普通饲料饲养4周。至10周龄时，分为对照组（9只）和P.gingivalis感染组（9只）。对照组尾静脉注射50μL的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）；P.gingivalis感染组尾静脉注射50μL含107个P.gingivalis细菌的PBS，每周1次，共10周。

1.2.3 标本收集 注射细菌第10周时，接种P.gingivalis后24h，小鼠禁食过夜，异氟烷吸入麻醉，眶后静脉取血后，实施安乐死，解剖分离主动脉树（从主动脉近心端到髂动脉），其中3只的主动脉树用于主动脉树苏丹Ⅳ染色，其他6只的主动脉树分3段分别用于免疫组织化学、免疫印迹、凝胶电泳迁移率实验检测。

1.2.4 主动脉树苏丹Ⅳ染色 小鼠主动脉树纵向剖开，固定于橡胶板上，4%的多聚甲醛固定24h，70%乙醇漂洗5min，0.5%苏丹Ⅳ（由35%乙醇和50%丙酮混合液配制）染色6min，80%乙醇脱染5min。数码相机拍照，采用Image－Pro plus 6.0软件测量分析。

1.2.5 血清炎症因子检测 血液标本肝素抗凝，4℃、3 000r／min离心5min，收集上层血浆。按照ELISA试剂盒说明书的实验操作步骤测定血液中TNF－α、MCP－1和IL－1β水平。

1.2.6 免疫组织化学染色 主动脉近心端1cm组织经固定、脱水、浸蜡和包埋制作石蜡切片，5μm连续切片后，脱蜡、水化和抗原修复，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，非免疫性动物血清封闭非特异性抗原，一抗TNF－α（1∶50）和 MCP－1（1∶50）4℃孵育过夜，加生物素化的二抗孵育，加SAB－HRP复合物，DAB显色，苏木精复染，最后脱水、透明、封片并拍照，图片采用Image－Pro plus 6.0软件分析。

1.2.7 免疫印迹检测 RIPA裂解液主动脉组织抽提蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度；聚丙烯酰胺凝胶电泳，每个上样孔加40μg蛋白样品，浓缩胶80V电泳20min，分离胶120V电泳60min；将电泳分离后的蛋白湿转法转膜到NC膜上；转膜后，以5%脱脂奶粉封闭NC膜，加一抗TLR－2（1∶1000）、TLR－4（1∶1 000）和 GAPDH（1∶1 500）4℃ 孵育过夜，加 HRP标记的二抗37℃孵育1h，用ECL化学发光法显色，最后扫描分析条带。

1.2.8 凝胶电泳迁移率检测 抽提主动脉组织核蛋白并测定浓度；用生物素3′末端DNA标记试剂盒将DNA探针标记上生物素；样品制备：样品体系包括DNA探针、待测核蛋白、NF－κB抗体、反应体系和上样缓冲液的混合液；将样品混合液加到上样孔里，进行非变性胶电泳；电泳后用湿转法进行转膜；转膜后用紫外交联仪进行交联；交联后的膜在封闭液中封闭后，加辣根过氧化物酶标记的链亲和素孵育，后加ECL化学发光试剂进行显色，扫描分析条带。

2 结 果

2.1 斑块面积变化 ApoE－／－小鼠主动脉树苏丹Ⅳ染色显示，P.gingivalis感染组斑块面积较对照组增加；量化分析显示，P.gingivalis感染组斑块面积百分比为（37.2±1.97）%，高于对照组（23.1±2.23）%（P＜0.05，图1）。

图1 主动脉粥样斑块形成Fig 1 Atherosclerotic plaque in aortic tree

2.2 血清炎症因子水平的变化 ELISA法检测血浆标本炎症因子水平，结果显示：P.gingivalis感染组 TNF－α水平为（348.09±17.97）pg／mL，显著高于对照组（202.46±16.62）pg／mL；P.gingivalis感染组 MCP－1水平为（755.34±41.53）pg／mL，明显高于对照组（510.99±15.87）pg／mL；P.gingivalis感染组IL－1β水平为（126.65±27.45）pg／mL，显著高于对照组（59.95±13.70）pg／mL（P＜0.05）（图2）。

2.3 ApoE－／－小鼠主动脉组织炎症因子水平 免疫组织化学染色主动脉组织切片显示：P.gingivalis感染组主动脉血管壁TNF－α和 MCP－1均较对照组表达增加（图3）。

图2 血液炎症因子水平Fig 2 Proinflammatory cytokines in blood

图3 主动脉组织炎症因子水平Fig 3 Expression of inflammatory cytokines in vascularwall

2.4 ApoE－／－小鼠主动脉组织 TLR－2、TLR－4蛋白表达水平和NF－κB活化水平 免疫印迹法检测显示：P.gingivalis感染组主动脉组织中TLR－2、TLR－4蛋白表达显著高于对照组（P＜0.05，图4A）。EMSA检测主动脉组织中NF－κB的活化水平，结果显示：P.gingivalis感染组明显高于对照组（P＜0.05，图4B）。

3 讨 论

牙周感染与心血管疾病密切相关，能加速AS的形成。ApoE－／－小鼠静脉注射P.gingivalis后，主动脉AS的形成加速[8]；同样，高脂血症小鼠口腔接种P.gingivalis后 ，无名动脉AS的形成加速[9]，提示牙周炎和牙周炎形成的菌血症均会促进AS进展加速。然而，前述研究未深入研究牙周致病菌促进AS的机制。本结果显示，牙周致病菌通过TLRs／NF－κB通路，促进全身的炎症反应，并且加重血管组织中的炎症反应，从而加速ApoE－／－小鼠AS的形成。

图4 主动脉组织TLR－2和TLR－4蛋白表达水平和NF－κB活化水平Fig 4 Protein expression of TLR－2、TLR－4and NF－κB activity in in aortic tissues

在炎症发生和进展过程中，TNF－α、MCP－1和IL－1β等促炎细胞因子能够活化和趋化免疫细胞，参与炎症反应。在人和动物的动脉粥样斑块中，均可观察到这些炎症细胞因子表达的上调，说明其参与 AS形成[10－11]。本实验观察到，P.gingivalis感染组血液中 TNF－α、MCP－1和IL－1β水平较对照组增加，主动脉组织中TNF－α和 MCP－1表达上调。炎症因子促进AS形成的可能机制是 MCP－1能趋化血液中的单核细胞向血管壁迁移，并转入内膜下分化为巨噬细胞；TNF－α和IL－1β能够活化内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞，进一步加重炎症反应和 AS的形成[12]。

TLRs是一组病原体相关分子型识别受体，能识别细菌、病毒和寄生虫等外界微生物的细胞壁、细胞膜或者纤毛等的保守序列，即病原体相关性分子型（pathogen associated molecule patterns，PAMPs），在微生物感染反应的固有免疫信号转导中起重要作用。在肺炎支原体促进AS的研究中，发现血管壁TLRs表达上调[13]。本实验结果进一步显示，P.gingivalis感染组主动脉组织中 TLR－2和TLR－4蛋白表达增加，这与Gibson等的结果一致[14]；Liu等报道 TLR－2－／－ApoE－／－小鼠 AS明显减少[15]。因此，推测P.gingivalis感染激活TLR－2和TLR－4的表达，通过级联信号传导，激活下游转录因子，激活细胞核内的基因转录，引发机体固有免疫炎症反应，活化免疫细胞，加重AS。

NF－κB是主要的炎症反应的转录因子，调控许多细胞因子、趋化因子、黏附分子、急性反应蛋白、生长因子等的表达。在人类AS病损的内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞中均能检测到活化的NF－κB[16]，NF－κB参与 AS形成的各个阶段。本实验观察到，P.gingivalis感染组主动脉组织中NF－κB活性增加，其可能机制是P.gingivalis依赖TLRs途径，介导NF－κB的活化。

本实验发现，血管壁的内皮细胞、单核细胞和中性粒细胞等防御系统的成分利用P.gingivalis感染，通过TLR识别血液中的牙周致病菌P.gingivalis，激活将信号转导给NF－κB，使转录因子p65亚单位进入细胞核内，与炎症细胞因子基因中的转录序列结合，启动多种炎症细胞因子的表达。各种炎症因子发挥相应的生物学效应，活化、趋化免疫细胞，促进血管局部和全身的免疫炎症反应，加速AS形成。

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