实验猕猴生殖道电生理学研究

李志雄 范春梅＊ 王 梅 徐 昕

（1.福建省人口和计划生育科学技术研究所 福州 350013；2.国家卫计委非人灵长类生育调节技术评价重点实验室 福州 350013）

生殖医学的不断发展，要求对实验猕猴排卵情况做出准确监测，现有的猕猴排卵监测手段在精确性和可操作性方面存在局限性，难以满足最新科研的需要。动物排卵测定仪对排卵的监测具有简便易行、准确、快速等可操作性优势，已广泛应用在家畜和野生动物的排卵监测，但在猕猴上尚未见报道。本研究目的在于探索猕猴阴道分泌物电阻值在月经周期中变化规律，并通过与血清E2比较，评价阴道分泌液电阻值作为预测猕猴排卵指标的价值，为建立猕猴的监测排卵方法提供理论依据。

1 材 料

1.1 实验动物

1.1.1 实验雌猴的选择 选择月经周期正常、健康状况良好、有正常生育史、年龄在6～10岁、性皮肤变化明显的雌猴33只。

1.1.2 实验动物的饲养管理 对实验所选的实验猴单笼饲养。在配种繁殖期间适当增加蛋白质及维生素E的饲料供应。实验猕猴由福建省人口和计划生育科研所提供，实验猴生产许可证（SCXK（闽）2010-0002）,使用许可证分别为(SYXK（闽）2010-0005）。

1.2 仪器设备 DRANINSKI狗排卵测定仪；贝克曼ACCESS全自动化学发光免疫分析仪；OLYMPUS高级生物显微镜。

1.3 试剂 贝克曼公司试剂批号：雌二醇935172；质控品：美国伯乐（批号：45232）。

2 方法

2.1 猕猴生殖道电阻值的测定

2.1.1 电阻值测定仪的准备与消毒 在空气中检测确保电池的电量。准备消毒剂，按消毒步骤的指示给探针消毒。清洗擦干实验猴阴道周围皮肤。

2.1.2 测定方法 固定猕猴，从阴道徐徐插入探针5～6 cm处，数秒后读取数据，探针旋转3周后再读数据，共读取3次，取其平均值；拔出探针后消毒。

2.1.3 测定时间 在繁殖季节里，月经周期的第2 d开始，每天检测实验猴生殖道电阻值，直至下次月经周期的到来或止于月经周期的第28 d。

2.2 雌二醇激素分泌水平的测定

2.2.1 Access测定原理 雌二醇的检测是一种使用了延时加入酶结合物的竞争结合的酶免疫检测。样品和包被了羊抗兔抗体：兔抗雌二醇捕捉抗体的磁性颗粒，以及含蛋白的Tris缓冲液一起被加入到反应管中，20 min以后，加入雌二醇-碱性磷酸酶酶结合物。样品中的雌二醇与雌二醇-碱性磷酸酶酶结合物竞争结合有限的特异性雌二醇抗体的结合位点，最后抗原-抗体复合物通过捕捉抗体结合到磁性颗粒表面。而后，反应管被传送到磁性分离区域进行多次冲洗，去除未和固相结合的其他成分。最后在反应管中加入化学发光底物（Lumi-Phos*530），该反应所产生的光子并被光电比色计所检测。光子的产量与样品中的雌二醇的浓度呈反比，最后，对照仪器中储存的多点定标曲线中所描绘的光量子与标准品雌二醇的对应关系而计算出样品中的雌二醇浓度。2.2.2 测定时间 在实验猴月经周期第8～12 d，每天上午9：00～10：00进行上肢隐静脉抽血、分离出血清，-80℃保存，全自动化学发光免疫分析仪检测E2。

3 结 果

3.1 猕猴不同月经周期生殖道电阻值检测结果33只实验用猴检测结果，见图1-图2。

图1 利用排卵测定仪检测猴生殖道电阻值检测结果

图2 按月经周期中所测电阻值最低值的时间为0 d，其前后时间里的检测结果

3.2 血清雌二醇的检测结果 33只实验用猴在月经周期的第8～12 d测定血清雌二醇的含量，结果见图3。

图3 血清E2检测结果

3.3 电阻值最低日与E2高峰日天数之差实验猴例数所占总例数的百分率 33个月经周期中，实验猴阴道电阻值最低日与E2高峰日天数之差的实验猴例数百分率，见表1、图4。

表1 实验猴阴道电阻值最低日与E2高峰日天数之差的例数百分率

4 结果分析

1）根据对实验猕猴阴道电阻值的检测，结果显示月经周期第11 d出现最低值。在猴卵泡期初始，月经周期的第4 d阴道电阻值由587±184Ω逐步下降至排卵期第11 d的213±179Ω，最低值在100Ω左右；随着黄体期的到来，电阻值又急速上升，到第16 d上升至 365±148Ω，第 22 d平稳在 390±140Ω水平。排卵期电阻值与卵泡期及黄体期的电阻值差异非常显著。以电阻值最低点均值76±33Ω与其前后1 d的电阻值均值194±32Ω和208±29Ω差异也非常明显（P＜0.01）。

图4 例数百分率饼状图

2）本实验血清E2高峰日出现在月经周期第10 d，浓度为187.8±123.3 pg/mL与张惠云等[1]报道相似（卵泡期 E2浓度为 245±193 pg/mL），E2的分泌高峰日与李沛等[2]通过针刺对雌性猕猴生殖内分泌影响的研究，发现雌性猕猴E2峰值出现在月经周期的第9±1 d相符合。阴道电阻值最低日与E2峰日吻合率为36.4%，提前1 d的例数占总数的18.2%，提前2 d的例数有21.2%，以上三者相加占总数的75.8%，说明生殖道分泌物电阻值最低日主要出现在E2峰日或在其后2 d内。刘宏伟[3]在排卵监测各指标的意义中认为血液中的E2主要来自优势卵泡，在卵泡发育进入活跃期后上升，并成倍递增，排卵前24～36 h 达峰值（雌激素第一峰＞732 pmo1/L），提示卵泡发育成熟；排卵后快速下降，约为峰值的50%。据报道，在排卵前雌激素峰值期，宫颈黏液的锯齿形变化现象最为显著，此系黏液素的存在形成的氯化钠晶体，排卵临近时，宫颈黏液中不仅氯化钠含量增加，而且体积增加10～12倍[4]。由于排卵前宫颈黏液稀薄，分泌量明显增加，易流入阴道内，与阴道内少量分泌液混合，排卵前氯化钠浓度增加，所测定的阴道电阻值必然减小。因猕猴阴道口小，阴道皱折多，位于胼胝底之间，难以应用扩张器械探查、采集宫颈黏液，因此，难以用宫颈黏液的评分方法来预测猕猴排卵。

3）使用排卵测定仪来监测动物（狐、羊、牛等）发情与排卵已得以证实。李涤非等[5]在北极狐发情阴道分泌物电阻值变化规律的观察中认为，“黏液电测法”完全可以用来进行雌狐的发情鉴定，当雌狐阴道分泌物电阻值达到最高峰，并开始急剧下降的第1～2 d放对，可很快达成交配。秦新等[6]用电阻测定母羊最适授精时间提高受孕率实验观察，用电阻测定法确定发情母羊最适配种，可使发情母羊冻配受孕率提高43%。根据吴元昌等[7]在发情鉴定仪测定母牛适宜配种时机实验结果证实，母牛发情前期电阻值最高，随着发情旺盛的出现电阻值逐渐下降，发情后期电阻值开始回升。

4）通过对猕猴的实验研究，揭示了月经周期内生殖道电阻值随着E2分泌水平的变化而呈现出有规律性变化。该法简便易行、无创伤、无副作用，适于在猕猴繁殖和相关科研中使用。可用B型超声仪监测猕猴卵泡发育及排卵动态情况，进一步研究与探索阴道电阻值与排卵的关系。

[1]张惠云,乔明,陈雨振,等.正常猕猴性周期相关指标的检测[J].中药药理与临床,2002,189(1):46-47.

[2]李沛,王训立.针刺对雌性恒河猴生殖内分泌抑制性影响的研究[J].中国针炙,1999,19(8):486-488.

[3]刘宏伟.排卵监测各指标的意义 [J].实用妇产科杂志,2008,24(8):457-460.

[4]Monghissi K S.Prediction and detection[J].Fertil Steril,1980,34:89.

[5]李涤非,耿孝媛,吴晓民,等.北极狐发情期阴道分泌物电阻值变化规律的观察[J].经济动物学报,2003,7(2):11-14.

[6]秦新,南朝俊,牛海昌,等.用电阻测定母羊最适授精时间提高受孕率[J].黑龙江动物繁殖,2004,12(1):29.

[7]吴元昌,郑羽,高建新.发情鉴定仪测定母牛适宜配种时机[J].畜牧兽医杂志,2008,27(2):92-93.