浦城县乳牛A型口蹄疫免疫效果检测分析报告

余明兴 詹文辉 江松洪 谢荣敏

（1.福建省浦城县动物疫病预防控制中心 363400；2.福建省南平市动物疫病预防控制中心 353000）

A型口蹄疫是由A型口蹄疫病毒引起偶蹄动物（尤其是猪、牛均可以发生）的急性、热性、接触性动物传染病（目前没有关于羊发生A型口蹄疫的报道），我国将其列为一类传染病，一旦发生，对畜牧业将造成巨大的经济损失，而且严重影响人民生活和畜产品贸易。为控制扑灭该病将要耗费大量人力、物力和财力，更严重的是，如果该病流行将给畜牧业造成致命影响，间接经济损失将远远超过直接经济损失。因此，做好该病的预防和控制非常重要，特别是做好该病的免疫预防尤为重要。因为，免疫是预防动物疫病十分重要也是十分必要的有效手段。

1 检测材料准备

5～50 μL移液器、0.2～10 μL移液器、50～200 μL移液器、50～300μL 12道移液器各一把；移液器枪尖（若干）；96孔一次性抗原抗体反应板；无离子水或蒸馏水；口蹄疫A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒；规模场乳牛血清40份。

2 操作步骤

1）用包被缓冲液稀释口蹄疫A型病毒兔抗血清至工作浓度，在酶标板上加50μL孔，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。

2）抗原抗体（对照血清及待检血清）反应：根据不同的需要，选择图1-图2中(试剂盒说明书)的一种布局在抗原抗体反应板上操作，图1抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图；图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。稀释血清：以图1为例操作，在96孔血清/病毒抗原反应板上，以50μL孔的量用PBST两倍连续稀释被检血清，从1∶4 至 1∶512。 同时稀释阳性对照血清， 从 1∶16～1∶2048；稀释阴性对照血清，从 1∶2～1∶4；将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL孔的量加入被检血清、阴性阳性对照血清至每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μL孔稀释至工作浓度的病毒抗原，振荡，2～8℃过夜加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，变为 1∶8～1∶1024。

图1 96孔酶标板检测10份样品布局图

图2 96孔酶标板检测20份样品布局图

3）用PBST连续洗酶标板5次，在洗水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至酶标板上的对应孔，50μL/孔，封板，37℃温育60 min。

4）同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液将口蹄疫A型病毒豚鼠抗血清稀释至工作浓度，加50μL孔，封板，37℃温育60 min。

5）同上洗板5次，甩干。用PBST将兔抗豚鼠ⅠgG-辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度，加50 μL/孔，封板，37 ℃温育 60 min。

6）同上洗板5次，甩干。在洗水纸上甩干，加50μL孔底物溶液 （底物溶液务必要加双氧水，每1 mL加10μL本试剂盒配备的3%双氧水），37℃孵育15 min。15 min后每孔再加50μL终止液终止反应，在酶标板上读取D492nm值。

3 检测结果判定方法

1）每块板设病毒抗原对照4孔和阴性阳性血清对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至工作浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入酶标板孔，50μL/孔。病毒抗原对照至少2个孔的D492nm值在 1.0～2.0； 阴性对照血清抗体效价应＜1∶8；阳性对照抗体效价应在1∶1024±1个滴度范围内。

2）以病毒抗原对照平均D492nm值的50%为临界值，被检血清D492nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔。某份血清系列稀释中，阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体效价，若临界值处于两个稀释孔D492nm值之间，抗体效价取相邻阳性孔和阴性孔稀释倍数的对数中间值，如处于1∶64（1og10 的对数值为 1.8）与 1∶128（1og10 的对数值为2.1）之间，则判定该份血清的抗体效价为1∶90（1og10的对数值为 1.95）。

3）抗体效价大于或等于1∶128判为口蹄疫A型抗体阳性；1∶64～1∶128 时，判为可疑；小于或者等于1∶64，判定为阴性。对于可疑血清样品，可以复测，复测抗体效价大于或等于1∶128，判为阳性，小于1∶128判为阴性。

4 检测结果

共检测40份乳牛血清，38份抗体阳性，2份抗体阴性，免疫抗体合格率达95%。

5 结果分析

1）检测结果表明，浦城县乳牛A型口蹄疫免疫抗体合格率较高，超过农业部的要求。这与浦城县采取的一系列防疫措施确保动物免疫质量提升密不可分。一是加大宣传力度，使乳牛场业主意识到A型口蹄疫的危害性，提高思想认识，自觉做好A型口蹄疫的免疫工作。二是加强督查指导，不定期到乳牛场进行技术指导，督促乳牛场将消毒制度、免疫制度、用药制度真正落实到位。三是强化疫苗储运管理，确保疫苗质量。四是规范免疫操作程序，确保免疫效果。

2）造成免疫效果不到位的原因很多。一是疫苗因素：免疫剂量是否正确、接种疫苗毒株与当地流行毒株血清型符合度、疫苗保管是否到位。二是免疫程序和技术人员操作因素。三是饲养管理和畜群健康水平情况的影响。要根据免疫抗体检测情况，查找问题、分析原因，加大免疫检测工作力度，掌握浦城县A型口蹄疫疫情动态，及时提出预警预报。