橙皮素及橙皮苷与牛血清白蛋白作用的比较

邹淑君，张蕾，郭迎喜，于子惠，许树军，马英丽

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

黄酮类化合物有广泛的药理活性，被吸收到血液里往往与血清蛋白发生相互结合而达到运送和分布的目的［1］。黄酮与蛋白结合作用的程度、强弱、位点等因素都可能影响它们的吸收、运输、释放及药效等。因此，探索黄酮类药物与蛋白质相互识别部位的结构特征及构效关系，有助于深入认识黄酮发挥药理作用的机理、药物代谢及药效等相关问题。

橙皮素(Hesperetin)是一种二氢黄酮，在自然界多以连接一个芸香糖的橙皮苷(Hesperidin)的方式存在。橙皮素和橙皮苷都存在于很多植物中，是中药材陈皮中的重要有效成分。具有广泛的生理活性［1］，如雌激素样活性、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗血小板凝聚、舒张血管、抗动脉粥样硬化及抗炎等作用［2-4］(结构式见图1)。本文采用多种光谱法测试二者与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，从作用机制、作用强弱、作用力类型、结合距离等测试它们与BSA作用的差异，并分析黄酮类物质A环7位羟基是否糖苷化对与BSA作用的影响。

图1 橙皮素和橙皮苷的结构式

1 试剂与仪器

RF-5301PC型荧光光度计(日本岛津公司);UV-1601PC型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);PB-20型pH计(德国赛多利斯仪器有限公司)。

橙皮素及橙皮苷(均为98%，上海晶纯实业有限公司)，二者分别用少量甲醇溶解后，再用二次蒸馏水定容，配成1×10-4mol/L的溶液;三羟甲基氨基甲烷(Tris，99.8%，上海博宏生物科技有限公司);牛血清白蛋白(BSA，99.8%，美国Sigma公司)，用pH值7.4的Tris-HCl缓冲液(含0.1mol/L NaCl)配成1×10-5mol/L，4℃保存。

2 实验方法

2.1 荧光猝灭光谱

分次取0～1000μL的橙皮素或橙皮苷溶液(每次间隔100μL)加入到盛有1.0ml BSA(1.0×10-5mol/L)溶液的10ml容量瓶中，用Tris-HCl(pH=7.40)缓冲液定容。进行3次上述操作，分别置于290K、300K、310K水中温浴15min后测定，固定激发波长280nm，扫描290～450nm范围内的荧光光谱(激发狭缝均为5nm，发射狭缝均为3nm)。

2.2 紫外-可见吸收光谱

室温下，以pH=7.4的Tris-HCl缓冲液为参比，在200～450nm范围内，分别扫描BSA溶液(1.0×10-6mol/L)、二氢黄酮溶液(1.0×10-6mol/L)和二氢黄酮与BSA(均为1.0×10-6mol/L)混合溶液的紫外光谱。

图2 橙皮素和橙皮苷对BSA的荧光猝灭光谱

3 结果与讨论

3.1 荧光猝灭光谱

图2为300K时，不同浓度的橙皮素或橙皮苷溶液存在下BSA的荧光发射光谱。由图2可见，二者都能明显猝灭BSA的内源荧光，且引起BSA的最大荧光发射波长红移，橙皮素存在下，红移2～3nm;橙皮苷存在下，红移1～2nm。红移表明氨基酸残基周围所处微环境亲水性增加，极性增强［5］。

在290nm～450nm范围内，橙皮素和橙皮苷在实验浓度下均无荧光发射，所以不需考虑“内部滤光效应”的干扰，则定义荧光猝灭率为η。

F0和F分别是加入化合物前后BSA的荧光强度，在实验浓度范围内二者对BSA的荧光猝灭率见图3。可见，同浓度的橙皮素对BSA的猝灭程度明显比橙皮苷大，表明A环7位羟基糖苷化会降低对BSA的荧光猝灭效率。

图3 橙皮素和橙皮苷对BSA的荧光猝灭效率

3.2 荧光猝灭机理

荧光猝灭通常以动态猝灭或静态猝灭为主。动态猝灭由猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的碰撞引起，猝灭常数随温度的升高而增大;静态猝灭由猝灭剂与荧光物质形成不发光的配合物引起，猝灭常数随温度的升高而减小。动态猝灭过程可根据 Stern-Volmer方程描述［6］。

式中F0和F分别为未加入和加入化合物时BSA的荧光强度，Kq为双分子碰撞猝灭常数，它反映体系中分子的彼此扩散和相互碰撞对生物大分子荧光寿命衰减速率的影响，且各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数为2.0×1010L/(mol·s)。［Q］为猝灭物质浓度。Ksv为Stern-Volmer猝灭常数，它描述荧光物质与猝灭剂分子彼此扩散和相互碰撞达到动态平衡时的量效关系。τ0为猝灭剂不存在时荧光分子的荧光寿命，对于生物大分子［10-11］τ0=10-8s。

若假设所考察的两种黄酮对BSA是动态猝灭，以(F0/F-1)对［Q］进行线性拟合，斜率就是Ksv，进而求得Kq，相应数据见表1。由表1可见，橙皮素、橙皮苷对BSA猝灭的Kq均大于2.0×1010L/(mol·s)，橙皮素猝灭BSA的Ksv随着温度的升高而减小，而橙皮苷猝灭BSA的Ksv随着温度的升高呈现不规律性变化。因此认为橙皮素对BSA的荧光猝灭不是动态猝灭，而是由于形成了复合物所引起的静态猝灭;橙皮苷对BSA的荧光猝灭既包含动态猝灭，也存在静态猝灭。

表1 橙皮素和橙皮苷与BSA作用的Ksv、Kq、Ka及n

图4 BSA-橙皮素及BSA-橙皮苷体系的紫外可见吸收光谱

3.3 紫外-可见吸收光谱

荧光动态猝灭影响到荧光体的激发态，而不改变荧光物质的吸收光谱，静态猝灭往往生成基态复合物，会导致荧光物质吸收光谱改变［6］。为进一步确定橙皮素和橙皮苷对BSA的荧光猝灭机理，考察了体系的紫外可见吸收光谱，见图4。

图4中谱线a是BSA的吸收峰，主要由色氨酸和酪氨酸芳杂环的π-π*和n-π*跃迁引起;谱线b是橙皮素或橙皮苷的吸收;c线是等浓度橙皮素/橙皮苷与BSA混合体系的吸收谱。由图4可见，橙皮素与BSA等浓度混合后，导致BSA在278nm处的最大吸收峰略红移。BSA也使橙皮素在320nm以后的吸收略红移;橙皮苷与BSA等浓度混合后，基本未导致BSA在278nm处的最大吸收峰发生移动。BSA使橙皮苷在320nm以后的吸收略红移，且有轻微增色效应。因此，进一步认为橙皮素对BSA的猝灭机理以静态猝灭为主;橙皮苷对BSA的猝灭机理以动态猝灭为主，但同时含有静态猝灭。

3.4 结合常数和结合位点数

小分子药物对蛋白质大分子的静态猝灭体系中，结合常数Ka及结合位点数n可以用下面的双对数方程式来推导［6-7］。

固定BSA的浓度，改变橙皮素或橙皮苷的浓度，以lg［(F0-F)/F］对 lg［Q］作图可得直线，由直线的斜率及截距可分别求得不同温度下反应的结合常数Ka及结合位点数n，相关数据见表1。由表1可知，BSA与橙皮素的结合常数Ka数值为104量级，结合位点数小于1，与橙皮苷的结合常数Ka数值为103～104量级，结合位点数大于1。说明这两种化合物可以被BSA储存和运输。并且同温度下，橙皮素与BSA结合程度明显大于橙皮苷与BSA结合的程度。

3.5 热力学参数和作用力类型

根据Ross等人的研究结果的分析方法，大致判断橙皮素及橙皮苷与BSA之间的作用力类型。在290～310K范围内二者与BSA作用的ΔG、ΔH及ΔS见表2。由表2可见，二者与BSA结合，均有ΔG＜0，表明它们与BSA的作用过程均为Gibbs自由能降低的自发过程。橙皮素与BSA的作用过程是ΔH＜0，ΔS＜0，表明氢键和范德华力是橙皮素与BSA间的主要作用力。对于橙皮苷与BSA的作用过程有:△H＞0，△S＞0，表明疏水作用力是橙皮苷与BSA的主要作用力［6-8］。

表2 橙皮素及橙皮苷与BSA作用的热力学参数及依据非辐射能量转移理论计算的结合距离

图5 橙皮素及橙皮苷的紫外吸收与BSA荧光光谱的重叠谱

3.6 作用距离

根据Föster能量转移理论，运用如下关系式就可以求出小分子在BSA上的结合位点与BSA分子中产生荧光的基团之间的距离r［8］。

其中E是能量转移效率;R0为E=50%的临界距离;F0和F分别为未加入和加入化合物时BSA的荧光强度;K2为偶极空间取向因子，一般取给体与受体各向随机分布的平均值2/3;n为介质折射常数，取水和有机物的平均值1.336;为BSA的荧光量子产率，通常取色氨酸的量子产率0.15;J为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分;F(λ)是荧光给体在波长λ处的荧光强度;ε(λ)是受体在波长λ处的摩尔吸光系数.根据公式(6)求出J，代入公式(5)求出R0，再根据公式(4)求出r。如果r＜7nm，就认为发生了非辐射能量转移［8］。

图5为300K，浓度为1.0×10-6mol/L的橙皮素或橙皮苷的紫外吸收光谱与1.0×10-6mol/L的BSA的荧光光谱的重叠图谱，相关数据计算结果见表2。

由表2可见，两种黄酮小分子在BSA上的结合位点与蛋白质分子中的色氨酸残基的距离均有r＜7nm，具备了能量转移猝灭蛋白质荧光的条件，因此非辐射能量转移也是二者引起BSA荧光猝灭的原因之一。橙皮素与BSA的结合位点与色氨酸残基的距离明显比橙皮苷与BSA的结合位点与色氨酸距离小，所以可以说明橙皮素与BSA色氨酸残基结合得更紧密。

4 结论

总结两种二氢黄酮对BSA的荧光猝灭率、猝灭常数、结合常数、结合位点数、作用距离等可以说明，黄酮A环7位羟基糖苷化导致与BSA之间的亲和力减弱，作用距离增大，且影响与BSA间的结合位点数及作用力类型。因此，橙皮素与BSA的结合能力明显强于橙皮苷，说明橙皮素比橙皮苷更容易被血清蛋白贮存和运输。也表明黄酮A环7位羟基是否糖苷化直接影响其与BSA相互作用的强度和结合力的方式。这在二氢黄酮及苷作为药物或食品添加剂使用时，从生物利用度、作用机理和代谢过程等方面考虑有重要的参考意义。

［1］ 张英霞，张云.血清白蛋白的功能及应用［J］.海南大学学报(自然科学版)，2007，25(3):315-320.

［2］ 刘学仁，张莹.橙皮苷和橙皮素生物活性的研究进展［J］.中国新药杂志，2011，20(4):329-333.

［3］ 邹淑君，于子惠，许树军，等.橙皮苷及橙皮素清除自由基活性的研究［J］.中医药学报，2013，41(1):65-67.

［4］ 魏晓芳，丁西明，刘会洲.pH诱导牛血清白蛋白芳香氨基酸残基微环境变化的光谱分析［J］.光谱学与光谱分析，2000，20(4):556-559.

［5］ 李悦，谷雨，何佳，等.光谱法与分子模拟技术研究杨梅素与牛血清白蛋白的相互作用［J］.化学学报，2012，70(2):143-150.

［6］ 董念，曹淑红，陈晓青，等.不同取代羟基黄酮类化合物与血清白蛋白的相互作用分析［J］.分析测试学报，2009，28(1):49-54.

［7］ Ross PD，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20(11):3096-3102.

［8］ 武旭芳，段志芳，李充璧.7-肉桂酰橙皮素铜配合物的固相合成及清除自由基作用研究［J］.中医药学报，2013，41(4):19-22.