电子鼻结合气质联用法分析大菱鲆冷藏过程中挥发性成分变化*

徐永霞，刘滢，姜程程，张朝敏，仪淑敏，励建荣

(渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州，121013)

大菱鲆，俗称欧洲比目鱼，在我国又称“多宝鱼”，是原产于土耳其北部沿岸的一种具有重要经济价值的鲆鲽鱼物种。自1992年引进至今，大菱鲆养殖已经发展成为年产量超过6万吨的海水养殖支柱产业，养殖产区主要集中在黄海北部和环渤海等北部沿海地区［1］。大菱鲆肉质鲜美，营养价值丰富，深受消费者喜爱。目前，大菱鲆相关的研究主要集中于餐桌饮食［2］、免疫学［3］、基因组学［4］、养殖和保鲜等方面，而对风味物质的研究较少。

近年来，针对于有复杂介质或含协同效应挥发性成分的样品而建立的气味指纹技术已运用于水产品风味方面的检测［5］。固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)技术是一种新型的无溶剂样品处理方法，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，简单方便，将SPME和气质联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用能够对挥发物进行准确定性和定量［6］。而电子鼻(electronic nose，E-nose)作为一种集分析、识别、检测复杂挥发性成分功能于一体的新型仪器，具有客观、准确、重复性好及无损等优点［5］。本研究采用电子鼻和SPME-GC-MS技术对大菱鲆鱼肉中的挥发性成分进行分析和鉴定，比较了其新鲜和腐败2个阶段挥发性气味的差异，期望为大菱鲆风味的深入研究及品质控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜养殖大菱鲆，购于锦州市林西水产市场，质量约600～800 g/尾;C8～C20正构烷烃标准品，Sigma公司;NaCl、MgO均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司;平板计数琼脂，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

PEN3便携式电子鼻系统，德国AIRSENSE公司;Agilent 7890N/5975气质联用(GC-MS)仪，美国Agilent公司;固相微萃取装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、20 mL顶空钳口样品瓶，美国Supelco公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司;Foss Kjeltec 8400，瑞典福斯集团公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理方式

将鲜活大菱鲆采用碎冰冻死，清洗沥干后用蒸煮袋包装于4℃冰箱中贮藏直至腐败。

1.3.2 测定指标及方法

感官评定:参照 Duflos［7］等人的方法并稍作修改，由6位经过培训的感官评定人员对鱼的气味、质地、外粘液、眼球和鱼鳃等进行评分，各指标的感官评定分值在0～3分之间;分值越低表明样品品质最好，0分代表最佳品质，3分代表最差品质。

细菌总数(TVC)的测定:根据GB/T 4789.2-2010的方法进行平板计数［8］。

挥发性盐基氮(TVB-N)的测定:参照FOSS方法［9］，采用自动定氮仪测定。结果表示为mg N/100 g鱼肉。

1.3.3 电子鼻检测

准确称取经绞碎的鱼肉1.0 g于25 mL的烧杯中，迅速用保鲜膜封口后置于4℃冰箱中静置30 min。电子鼻测定时间为100 s，顶空温度25℃，内部流量300 mL/min，进样流量300 mL/min。每个样品重复测定3次。PEN3型便捷式电子鼻传感器性能描述见表1。

1.3.4 GC-MS分析

固相微萃取:准确称取经绞碎的鱼肉3.0 g于20 mL顶空瓶中，加入6 mL饱和NaCl溶液及磁转子，用聚四氟乙烯隔垫密封，于60℃磁力搅拌器中加热平衡15 min。用已活化好的DVB/CAR/PDMS 50/30 μm萃取头(270℃活化60 min)顶空吸附40 min后，将萃取头插入GC进样口，解吸5 min。每个样品重复实验2次。

气相色谱条件:HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);进样口温度为250℃，不分流模式进样;载气为He，流速1.0 mL/min;程序升温:柱初温40℃，保持3 min，以3℃/min升至100℃，再以5℃/min升至230℃，保持5 min。

质谱条件:色谱-质谱接口温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃;离子化方式:EI;电子能量70 eV;质量扫描范围30～550(m/z)。

1.4 数据分析

电子鼻数据分析:取稳定后第84 s～88 s这5 s的数据信息进行主成分分析(PCA)。

表1 PEN3型便捷式电子鼻传感器性能描述Table 1 Properties of sensor on PEN3 electronic nose

GC-MS数据分析:样品中挥发性成分的定性分析采用计算机谱库(NIST 11/Wiley 7.0)进行检索，并利用C8～C20正构烷烃的保留时间计算各个色谱峰的保留指数，确认挥发性物质的化学组成。挥发性成分的定量分析采用峰面积归一化法。

2 结果与讨论

2.1 常规新鲜度评价指标分析

新鲜及腐败鱼肉的感官评分、细菌总数和TVBN值如表2所示。整个贮藏过程中大菱鲆的感官评分值逐渐升高，说明其品质逐渐下降，在20d时感官品质不可接受。由表2可知，随贮藏时间的延长菌落总数逐渐增加，贮藏20 d时已超过国标规定的卫生标准［10］。TVB-N是评价鱼类新鲜度的重要指标，当TVB-N值达到30 mg/100 g被认定为货架期终点［11］。大菱鲆贮藏过程中的TVB-N值逐渐升高，第20天的TVB-N值为44.34 mg N/100 g。通过以上指标的测定结果表明，贮藏20 d的鱼肉已达到腐败阶段。

表2 新鲜及腐败大菱鲆鱼肉新鲜度指标测定结果Table 2 Results of freshness indices of fresh and spoiled turbots

2.2 电子鼻检测

采用电子鼻检测分析新鲜和腐败鱼肉样品的气味差异，结果如图1和2所示。由图1可以看出，新鲜和腐败鱼肉样品的风味轮廓之间存在显著差异，响应值变化较为明显的传感器由大到小分别是R(7)、R(9)、R(6)和R(2)，这说明相比新鲜鱼肉样品，腐败鱼肉中无机硫化物R(7)、芳香成分和有机硫化物R(9)、烷烃类R(6)和氮氧化合物R(2)的含量明显升高，从而使得腐败样品中呈现出臭味。同时采用SPSS19.0软件分析新鲜及腐败鱼肉风味对10个传感器的响应值可得出2种样品的相关性系数为0.814，说明其差异性较显著。为进一步表征新鲜和腐败鱼肉样品之间气味的差异，采用PCA法对这些气味指纹数据进行数理统计。由图2可知，第一主成分(PC1)贡献率达到99.87%，PC1和PC2贡献率之和达到99.98%，能较好地反映原始高维矩阵数据的信息，说明电子鼻能有效区分新鲜和腐败鱼肉的气味变化。该方法的分析结果与感官评分、菌落总数和TVB-N值的变化相一致。此外，用GC-MS对挥发性风味成分进行进一步分析和鉴定。

图1 新鲜及腐败鱼肉样品的气味感应强度雷达图Fig.1 The radar chart of odour in fresh and spoiled turbot samples

图2 新鲜和腐败鱼肉样品的PCA分析Fig.2 PCA plot of fresh and spoiled turbot samples based on electronic nose signals

2.3 GC-MS分析结果

新鲜及腐败的大菱鲆鱼肉中挥发性成分组成及其相对含量见表3。分别鉴定出27、28种挥发性物质，主要包括醛类、酮类、醇类、酯类、烃类、芳香族和胺类化合物等。图3为新鲜和腐败鱼肉中检测到的各类挥发性物质相对含量及组成。由图3可知，醛类、酮类和醇类物质在新鲜鱼肉中相对含量较高，而腐败鱼肉中胺类物质的相对含量较高。非常新鲜的鱼通常具有柔和的、浅淡的、令人愉快的气味，而鲜鱼的这种气味通常是由醛类、醇类和醇类引起的［12］。

2.3.1 羰基化合物

羰基化合物包括醛类和酮类物质，在水产品气味特征中起重要作用。醛类是大菱鲆主要的挥发性物质之一，在新鲜和腐败的鱼肉中分别检测到5、7种醛类物质，其相对含量分别为25.64%和14.94%。醛类物质主要由多不饱和脂肪酸氧化产生，且阈值很低，尤其是C6～C12的饱和醛类物质的阈值极低，对鱼类总体气味特征有重要影响［13］。其中己醛具有青草味、腥味，庚醛具有果香，壬醛具有鱼腥味，苯甲醛具有令人愉快的坚果香。由表3可知，这4种醛类物质在新鲜鱼肉中的相对含量明显高于腐败鱼肉。3-甲基丁醛仅在腐败鱼肉中检出，这种物质可能是由Strecker降解或微生物活动产生［14］。研究报道［15］，煮熟的去皮虾肉冷藏期间感官品质的劣变与3-甲基丁醛的产生密切相关。实验中共检出4种酮类物质，在新鲜鱼肉中的相对含量较大，尤其是2，3-辛二酮和(E，E)-3，5-辛二烯-2-酮。酮类物质具有特殊的香气，由于其阈值较高，对鱼肉气味的贡献相对较小［16］，但酮类对腥味具有增强作用，尤其是烯酮类化合物。

2.3.2 醇类化合物

醇类物质主要是由脂肪酸氧化酶作用于多不饱和脂肪酸衍生而来的。大菱鲆中检出的醇类含量也较大，在新鲜和腐败鱼肉中分别为24.79%和18.32%。醇类物质一般阈值较高，对整体气味的贡献较小。但不饱和醇阈值相对较低，具有蘑菇香气和类似金属味，对鱼肉风味有一定作用。其中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇在新鲜鱼肉中的含量远高于腐败鱼肉，研究发现，这2种醇类化合物可能是熏制鲑鱼鲜度指示物［17］。而3-甲基-1-丁醇仅在腐败鱼肉中检出，且相对含量较高。研究报道，3-甲基-1-丁醇与微生物的代谢有关，可能是鱼类腐败变质的潜在挥发性指示物［14］。

图3 新鲜及腐败大菱鲆鱼肉挥发性成分的比较Fig.3 Comparison of volatiles compounds in fresh and spoiled turbot flesh

2.3.3 烃类及芳香族化合物

由表3可知，实验中检测到较多的烃类物质(烯烃类和烷烃类)。烯烃类化合物在一定条件下可形成醛和酮，是产生鱼腥味的潜在因素。其中D-柠檬烯在新鲜和腐败2个阶段均被检出，且相对含量较大。柠檬烯类物质可能产生于周围的环境中［18］。C8～C19的烷烃类物质气味阈值较高，因此对鱼肉整体风味的贡献较小。此外，在新鲜和腐败鱼肉中均检测到3种芳香族化合物，包括对伞花烃、萘和丁羟甲苯，这类化合物可能来自环境中的污染物。其中，萘已在龙虾、扇贝和蟹中检出［19］。

表3 新鲜及腐败大菱鲆鱼中挥发性成分的GC-MS分析结果Table 3 Volatile compounds of fresh and spoiled turbot flesh analyzed by GC-MS

2.3.4 胺类及其他化合物

鱼体中胺类化合物主要是由于各种氨基酸在细菌的脱羧作用下生成的，这些物质一般都有腥臭味［12］。由表3可知，在腐败鱼肉中检测出三甲胺，且含量很高。三甲胺是三甲胺氧化物在细菌酶的作用下产生的，呈现出令人不愉快的氨味并广泛存在于水产品中，通常作为评价水产品新鲜度的一个重要指示物［20］。实验中共检出4种酯类物质，这类物质在新鲜鱼肉中的相对含量高于腐败鱼肉。此外，在腐败鱼肉中检出乙酸。乙酸主要由乳酸菌作用产生的，会产生非常强烈的令人不愉快的汗味，Jónsdóttir等人研究认为乙酸为熏制鲑鱼腐败等级的评价指标之一［21］。

3 结论

通过测定大菱鲆在4℃冷藏过程中的感官、菌落总数和TVB-N值等指标的变化，确定鱼肉在贮藏20d时已达到腐败阶段。电子鼻结果显示，新鲜和腐败鱼肉的气味差异明显，电子鼻数据PCA分析可以很好地区分新鲜和腐败鱼肉样品，该方法的分析结果与传统指标的变化相一致;GC-MS分析结果表明，在新鲜和腐败鱼肉中分别检测到27和28种挥发性物质，其中醛类、酮类和醇类物质在新鲜鱼肉中的含量较高，而胺类物质在腐败鱼肉中含量较高。其中己醛、庚醛、(E，E)-2，4-庚二烯醛、1-戊烯-3-醇和 1-辛烯-3-醇等物质在新鲜鱼肉中的含量明显高于腐败鱼肉，可能作为表征鱼肉新鲜的挥发性指示物，而3-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、三甲胺仅在腐败鱼肉中检出，且相对含量较高，可能作为鱼肉腐败的标志物。

［1］ 雷霁霖，刘新富，关长涛.中国大菱鲆养殖20年成就和展望［J］.渔业科学进展，2012，33(4):123-130.

［2］ Peng M，Xu W，Ai Q H，et al.Effects of nucleotide supplementation on growth，immune responses and intestinal morphology in juvenile turbot fed diets with graded levels of soybean meal(Scophthalmus maximus L.)［J］.Aquaculture，2013，392-395:51-58.

［3］ Zhang Z，Wang Y，Wang Q，et al.Study on the immune enhancement of different immunoadjuvants used in the pentavalent vaccine for turbots［J］.Fish ＆ Shellfish Immunology，2012，32(3):391-395.

［4］ Haffray P，Lebègue E，Jeu S，et al.Genetic determination and temperature effects on turbot Scophthalmus maximus sex differentiation:An investigation using steroid sex-inverted males and females［J］.Aquaculture，2009，294(1/2):30-36.

［5］ 顾赛麒，王锡昌，陶宁萍，等.基于固相微萃取-气-质联用法和电子鼻法检测锯缘青蟹挥发性风味物［J］.食品工业科技，2012，33(14):140-145.

［6］ Kataoka H，Lord H L，Pawliszyn J.Applications of solidphase microextraction in food analysis［J］.Journal of Chromatography A，2000，880(1/2):35-62.

［7］ Duflos G，Leduc F，N＇Guessan A，et al.Freshness characterisation of whiting(Merlangius merlangus)using an SPME/GC/MS method and a statistical multivariate ap-proach［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，90(15):2 568-2 575.

［8］ GB/T 4789.2-2003.食品中细菌总数的测定方法［S］.

［9］ FOSS.Determination of total volatile basic nitrogen of fresh fish and frozen Fish［J］.Application Sub Note，2002，8:16.

［10］ GB 18406.4-2001.农产品安全质量无公害水产品安全要求［S］.

［11］ Gökodlu N，Özden Ö，Erkan N.Physical，chemical and sensory analyses of freshly harvested sardines(Sardina pilchardus)stored at 4 ℃［J］.Journal of Aquatic Food Product Technology，1998，7(2):5-15.

［12］ 章超桦，解万翠.水产风味化学［M］.北京:中国轻工业出版社，2012:41.

［13］ 吴容，陶宁萍，刘源，等.同时蒸馏萃取-气质联用分析养殖暗纹东方鲑肉中的挥发性成分［J］.食品与发酵工业，2012，38(9):132-140.

［14］ Soncin S，Chiesa L M，Panseri S，et al.Determination of volatile compounds of precooked prawn(Penaeus vannamei)and cultured gilthead sea bream(Sparus aurata)stored in ice as possible spoilage markers using solid phase microextraction and gas chromatography/mass spectrometry［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89(3):436-442.

［15］ Fall P A，Pilet M F，Leduc F，et al.Sensory and physicochemical evolution of tropical cooked peeled shrimp inoculated by Brochothrix thermosphacta and Lactococcus piscium CNCM I-4031 during storage at 8 ℃［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，152(3):82-90.

［16］ 王霞，黄健，侯云丹，等.电子鼻结合气相色谱-质谱联用技术分析黄鳍金枪鱼肉的挥发性成分［J］.食品科学，2012，33(12):268-272.

［17］ Duflos G，Coin V M，Cornu M，et al.Determination of volatile compounds to characterize fish spoilage using headspace/mass spectrometry and solid-phase microextraction/gas chromatography/mass spectrometry［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，86(4):600-611.

［18］ Lu F，Zhang J Y，Liu S L，et al.Chemical，microbiological and sensory changes of dried Acetes chinensis during accelerated storage［J］.Food Chemistry，2011，127(1):159-168.

［19］ Boonsumrej H，Chaiwanichsiri S，Tantratian S，et al.Effects of freezing and thawing on the quality changes of tiger shrimp(Penaeus monodon)frozen by air-blast and cryogenic freezing［J］.Journal of Food Engineering，2007，80(1):292-299.

［20］ Cha Y J，Baek H H，Hsieh T C Y.Volatile components in flavour concentrates from crayfish processing waste［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2006，58(2):239-248.

［21］ Jónsdóttir R，Ólafsdóttir G，Chanie E，et al.Volatile compounds suitable for rapid detection as quality indicators of cold smoked salmon(Salmo salar)［J］.Food Chemistry，2008，109(1):184-195.