生物转化合成β-苯乙醇代谢途径及其调控的研究*

杜闪，王雪花，杨政茂，刘笑生，宋焕禄，王凤寰，王肇悦

1(北京工商大学分子感官科学实验室，北京，100048)

2(北京工商大学食品学院，北京，100048)3(中国科学院微生物研究所，北京，100101)

β-苯乙醇(β-Phenylethanol)是一种芳香族伯醇，常温下是无色液体，具有淡雅、细腻而持久的玫瑰花香［1］，具有抑菌性能，可作为多种香型的底香组分，在食品、日化用品和烟草等中添加，对其他的香气成分有增效作用，且对护肤品有保质作用［2］。

β-苯乙醇的生产方法有3种:生物资源提取法、化学合成法及微生物转化法［3］。微生物转化法为“天然”产品，虽然成本高，但安全、口感好、味道自然，受到消费者青睐。欧洲立法规定，如果对终产品要标称“天然”，则也要求作为前体的原料必须是“天然”的。通过艾氏途径生产β-苯乙醇，以L-苯丙氨酸为惟一氮源时，β-苯乙醇的产量有显著提高。市场上的L-苯丙氨酸基本采用微生物发酵法或酶法生产，无疑是属于天然产品的，而且市场价格便宜，可以满足大规模的生物转化法生产β-苯乙醇的需求。

1 合成β-苯乙醇的微生物

许多发酵食品中均含有 β-苯乙醇，如可可、咖啡、面包、果汁、啤酒、奶酪以及酱油等［3］。事实上，许多酵母菌具有从头合成和生物转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的能力，例如马克斯克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、异常汉逊酵母等。不少真菌如猴头菌、黑曲霉等也具有从头合成或转化L-苯丙氨酸为β-苯乙醇的能力，但相对而言，其合成或转化能力较差。目前已报道的用于转化L-苯丙氨酸生成β-苯乙醇的较多的菌种是酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母、中国克鲁维酵母3种［4］。

2 合成β-苯乙醇的代谢途径

2.1 苯丙酮酸途径

在一些酵母中，β-苯乙醇可通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径从头合成［3，5］。代谢途径见图1。

图 1 L-苯丙氨酸代谢途径［3，5］Fig.1 L-phenylalanine(L-Phe)metabolism［3，5］

由糖酵解过程中产生的磷酸烯醇式丙酮酸，与磷酸戊糖途径中产生的4-磷酸赤藓糖在2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP合酶)作用下通过中间体DAHP形成莽草酸，再经中间体分支酸和预苯酸在分支酸变位酶和预苯酸脱水酶的作用下形成苯丙酮酸，苯丙酮酸一方面可通过苯乙醛生成β-苯乙醇;另一方面，也可通过与L-谷氨酸的转氨作用形成L-Phe。代谢途径中DAHP合酶及预苯酸脱水酶受到L-Phe的反馈抑制。这条途径广泛存在于微生物体内，但是代谢途径太长，支路太多，并存在着多种抑制作用，所以最终得到的β-苯乙醇产量很低。

2.2 艾氏途径

生物转化合成β-苯乙醇的另一条途径是L-苯丙氨酸通过氨基酸的转氨作用生成苯丙酮酸，再脱羧形成苯乙醛，苯乙醛经氧化脱氢酶作用生成β-苯乙醇，代谢途径见图2。这个途径首先是由Ehrlich发现，后来便以他的名字命名［4，6-7］。其中 2-含氧酸的脱羧作用是艾氏途径中杂醇形成的关键步骤［8］。还有一条途径为L-苯丙氨酸去羧基生成苯乙胺，苯乙胺通过去氨基作用生成苯乙醛，苯乙醛再经过还原作用生成苯乙醇，但通常情况下这个途径很少发生。

图2 艾氏途径转化L-苯丙氨酸生成苯乙醇［9］Fig.2 β-phenyl ethanol produced by Ehrlich pathway transformation L-phenylalanine［9］

在微生物细胞中，β-苯乙醇合成走哪一条途径取决于培养基中的氮源［10］。谷氨酸、铵盐等一般作为优质的、较易利用的氮源使用，而氨基酸、尿素等只作为次级氮源使用。但是，只有当L-苯丙氨酸作为唯一氮源时，艾氏途径才占优势。如果环境中有其他更容易利用的氮源存在，即使在较高的L-苯丙氨酸浓度条件下，L-苯丙氨酸仍有一部分通过其它途径被代谢［10］。如通过肉桂酸途径(如图1)降解为3-酮基乙二酸进入TCA循环，而且这个降解途径不能完全被抑制，所以任何条件下，L-苯丙氨酸不可能完全转化为 β-苯乙醇［5］。

3 艾氏途径中相关酶及其编码基因的研究

作为利用微生物合成β-苯乙醇的首选途径，艾氏途径在近几年里已在基因水平上得到了广泛而深入的研究，研究的重点在于编码艾氏途径3个步骤中3种酶的结构基因及其转录和调控，如图3所示［11］。这3种酶分别是转氨酶、脱羧酶和醇脱氢酶。第一步反应的转氨酶与菌体的生理生长密切相关，通过与α-酮戊二酸之间的转氨作用与TCA循环紧密联系。但是目前吸引绝大多数研究者注意的是第二步反应中苯丙酮酸脱羧酶的基因本质，它是艾氏途径中的关键酶［5］。

3.1 转氨酶编码基因及其调控

图3 艾氏途径(支链氨基酸(亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和含硫氨基酸(甲硫氨酸)的代谢导致杂醇和杂酸的形成。该图指出了编码艾氏途径每一步反应所需酶的基因［11］)Fig.3 The Ehrlich pathway

艾氏途径中的第一步反应是转氨酶催化进行的。Kradolfe利用DEAE层析分离得到参与第一步的转氨作用的两个酶:一个是芳香族转氨酶I(ARO8)，在酵母中是组成型表达，能够催化与苯丙氨酸相关的绝大部分转氨反应，它在细胞内普遍存在，是主要的芳香族转氨酶［12］;另一个是芳香族转氨酶II(ARO9)，是诱导表达蛋白［13］。

3.1.1 芳香族转氨酶I(ARO8)

当菌体在含有芳香族氨基酸的条件下生长时，需要有芳香族转氨酶I催化进行。该酶与酪氨酸和苯丙氨酸的亲和力是色氨酸的20倍［14］。缺失aro8的突变菌株不能在这些氨基酸是唯一氮源的条件下生长，这一事实并不适用于所有条件中的第一步转氨基反应:(1)所有条件下都不能生长;(2)必须含有芳香族氨基酸(类似于尿素培养基中加入诱导物)［14-15］。

3.1.2 芳香族转氨酶II(ARO9)

芳香族转氨酶II是分解代谢中的一个诱导酶，且在生长时合成代谢中通常不表达。但是，在aro8基因缺失的突变株中可以催化苯丙氨酸和酪氨酸的生物合成［14］。

芳香族转氨酶II的编码基因为ARO9基因，有以下特性:(1)培养基内的酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸可以诱导ARO9基因的转录，当缺失这些诱导物时，其转录水平很低;(2)芳香族转氨酶II催化这些氨基酸分解代谢的第一步反应;(3)该酶在以苯丙氨酸或酪氨酸为唯一氮源的条件下不是必须的，但是aro9突变体在色氨酸或犬尿酸为唯一氮源的条件下生长缓慢;(4)初期表达研究表明，当诱导物存在的情况下，氨效应抑制ARO9的表达;(5)芳香族氨基酸诱导ARO9基因表达需要一个36bp的元件UASaro以及反式作用元件ARO80p，UASaro是Aro80p的DNA结合部位［16］。结合部位在ARO9及ARO10基因的启动子中，含有特殊的 WRCCGWSATTTRCCG 基序［11］。

3.1.3 其他转氨酶

Twt1p(又称为Bat1p或Eca39p)是线粒体支链氨基酸转氨酶，而Twt2p(Bat2p or Eca40p)是细胞质内的同工酶。当分批培养时，线粒体内的同工酶在对数期大量表达，但是在稳定期时受到抑制;细胞质内的同工酶则相反［11］。

3.2 苯丙酮酸脱羧酶编码基因及其调控

酿酒酵母基因组中含有5个可能编码苯丙酮酸脱羧酶活性的基因，包括3个丙酮酸脱羧酶基因PDC1、PDC5、PDC6，以及另外两个认为有编码以焦磷酸硫胺素为辅酶的脱羧酶活性的可读框ARO10/YDR380w、THI3/YDL080c［17-18］。报道中酿酒酵母中丙酮酸脱羧酶Pdc1和Pdc5、Pdc6的编码基因PDC1、PDC5和PDC6以及相关的THI3和ARO10基因可影响杂醇及杂酸的产生［19-21］。

3.2.1 丙酮酸脱羧酶PDC

丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase，PDC)是酿酒酵母代谢途径中的关键调节酶，其活性直接影响酿酒酵母发酵产物［22］，属于二磷酸硫胺素(thiamine diphosphate，ThDP)依赖性非氧化酶［23-24］。

PDC1和PDC5在多数培养条件下编码主要的丙酮酸脱羧酶［19，25-26］。在酵母细胞中，PDC5 的表达量低于PDC1的表达量的10%。然而，当PDC1缺失时，会强烈刺激PDC5的启动子活性，激发PDC5的表达;当PDC1开放阅读框缺失时，同样激发PDC5启动子的活性。这种现象成为“自身调节”［27］。除了自身调节之外，PDC1和PDC5的表达还受到碳源、硫胺素以及可能的其他营养的信号和生长期的控制。(1)葡萄糖可以使PDC1的表达量提高3～10倍，实际的诱导程度因不同菌种而异;在PDC1缺失的情况下，PDC5的表达量大约提高50倍，使得PDC5成为糖酵解相关基因中碳源效应最强的基因。当葡萄糖浓度很高时，Pdc参与的反应会进一步增强。目前碳源效应的机制尚不明确［27］。(2)硫胺素强烈抑制PDC5的表达，而不是PDC1。在硫胺素存在的情况下，PDC5的表达量远远低于PDC1，其启动子活性几乎检测不到;当没有硫胺素时，PDC1启动子活性比硫胺素存在时略低［28］，但PDC5的表达量与PDC1缺失的菌株在有硫胺素时的表达量是相当的［27］，有很大的提高。(3)此外，PDC1和PDC5的表达还需要转录 因 子 Pdc2p［8，27，29］。在 pdc2 缺 失 的 条 件 下，PDC1的表达量下降至原来的10%，而对于PDC5而言，即使在 PDC1缺失的突变株中，也完全不表达［27］;(4)PDC5 的表达还取决于 THI3 基因［11］。

PDC6仅仅在含硫低的条件下表达，并编码一种含硫氨基酸较少的丙酮酸脱羧酶［8，19，30-32］。

在分批培养的条件下，无论是葡萄糖为唯一碳源，或者是再添加乙醇或醋酸盐的基本培养基中，pdc缺失的酿酒酵母不能在含有葡萄糖的条件下生长［33］。

3.2.2 THI3

THI3(ORF YDL080c)编码一个与丙酮酸脱羧酶(Pdc)十分相似的蛋白质。THI和PDC1、PDC5基因的 高 水 平 表 达 需 要 调 控 蛋 白 Pdc2p［27，29，34］。YDL080c可以催化含支链2-含氧酸的脱羧，并调控硫胺素代谢中的相关基因［21］。但是，Thi3在硫胺素合成中的作用是调节作用，不是催化作用［8，11］。当仅有THI3基因时，不能检测出的α-酮酸脱羧酶活性［11］，不能催化苯丙酮酸或者丙酮酸脱羧［21］。另一方面，Pdc1、Pdc5、Pdc6及 Aro10存在于细胞质中，而Thi3不仅存在于细胞质中，还存在于细胞核中，这更加证实了其调节作用［11］。

3.2.3 苯丙酮酸脱羧酶ARO10

ARO10基因的上游调节序列与ARO9基因非常相似，也具有36 bp的上游激活序列，受Aro80p诱导调控［16］。两者的诱导表达还受制于一种铵盐效应，生长在次级氮源条件下的细胞加入铵盐时，诱导作用受阻。此外，ARO10受色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及甲硫氨酸等的诱导作用可提高其转录或表达水平［19］。通过多表达ARO10基因，证明该基因受碳源和氮源的转录后调控;或者Aro10p的催化活性和/或稳定性需要至少一个蛋白的存在，这种蛋白的表达依赖于碳源和氮源［19］。

Vuralhan等证明苯丙酮酸脱羧酶活性主要由ARO10基因决定的［21］。在不同氮源的条件下，5个基因中只有ARO10基因的转录水平有较大改变［19］。当分别超表达 pdc1、pdc5、pdc6、aro10 及thi3 时，只有Pdc1，Pdc5和Pdc6催化细胞提取物中的直链2-氧-丙酮酸、2-氧-丁酸甲酯和 2-氧-戊酸［8］，仅有 Aro10 和Pdc5可以催化芳香族底物苯丙酮酸的脱羧，而Aro10表现出较好的动力学特征。Aro10、Pdc1、Pdc5以及Pdc6在所有支链及含硫2-含氧酸测试中显示出活性。Aro10的高亲和力说明它是形成含支链及含硫的杂醇油的关键因素［8］。

不依赖于ARO10的苯丙酮酸脱羧酶活性需要有TDL080c和至少一个 PDC 基因同时存在［20，35］。

3.3 醇脱氢酶编码基因及其调控

艾氏途径的最后一步是杂醇醛还原或氧化分别形成杂醇或杂酸［36］。对于β-苯乙醇而言，是经过还原反应形成。在杂醇形成过程中必须经由几个氧化还原酶来催化，包括:乙醇脱氢酶［20，36，37］、甲醛脱氢酶 Sfa1p［20］、3-甲基丁醛还原酶［36，38］、阿尔多酮还原酶 Ypr1p［36，39］以 及 至 少 一 个 假 定 的 芳 醇 脱 氢 酶(AAD6)［18，36］。

酿酒酵母编码乙醇脱氢酶基因主要有五个:ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5，其中乙醇脱氢酶Adh1p、Adh3p、Adh4p和Adh5p在发酵过程中执行还原乙醛生成乙醇功能，而乙醇脱氢酶Adh2p则行使催化乙醇生成乙醛的生物学功能［40，41］。Adh1p，Adh2p和Adh3p都需要锌［20］。艾氏途径中的最后一步(形成杂醇)可以被Adh1p～Adh5p中的任何一个或者 Sfa1p(甲醛脱氢酶)催化［11，20］。

3.3.1 乙醇脱氢酶Ⅰ(ADH1)

在糖酵解生成醇的过程中Adh1p是主要的细胞质酶［20］，并在乙醇发酵中起主要作用［42］。ADH1 基因缺陷型酿酒酵母在厌氧或者存在呼吸抑制剂的条件下生长缓慢［43］。ADH1基因的过表达可以增强酿酒酵母的甲醛抗性［44］。

3.3.2 乙醇脱氢酶Ⅱ(ADH2)

尽管ADH1和ADH2有89%的序列相似性，但其底物亲和力不同，Adh2p对乙醇有高度亲和力，主要负责醇的降解［42］。Adh2p也是细胞质酶，但是受到葡萄糖的抑制，需要在醇中生长［20］。缺乏adh2活性的菌株不能在以乙醇为唯一碳源的培养基上生长。adh2缺陷型菌株在发酵时可以积累大量甘油［45］。

3.3.3 乙醇脱氢酶Ⅲ(ADH3)

ADH3主要编码线粒体基质中的乙醇脱氢酶同功酶［20］。乙醇脱氢酶ADH3具有催化乙醇分解的生物学功能，可降低酵母细胞乙醇产率［41］。Adh3p受葡萄糖的诱导［20］，环境中葡萄糖的存在抑制ADH3的表达，但其抑制程度较 ADH2低［43］。Adh3p的缺失破坏了线粒体的氧化还原代谢平衡环境［42］。adh3基因缺陷菌株在好氧条件下的生长速度与野生型菌株相比，基本没有变化［46］。但是在厌氧条件下，adh3基因缺陷菌株生长明显比野生型缓慢［42］。

3.3.4 乙醇脱氢酶Ⅳ(ADH4)

该基因在大多数实验菌株中其表达量很低，但在发酵菌株中却很高［20］。锌离子可以维持Adh4p蛋白活性，并且在没有锌的环境中能诱导该基因的转录［47］。与此同时，ADH4基因的表达可以受到锂离子的增强和DMSO(二甲基亚矾)的抑制［48］。

3.3.5 乙醇脱氢酶Ⅴ(ADH5)

乙醇脱氢酶Ⅴ(ADH5)是在基因组序列中发现的，目前它的功能尚不清楚［20］。

3.3.6 甲醛脱氢酶(SFA1)

Sfa1p(sensitive to Form AldehydeⅠ)，是一个双功能酶，具有降解长链醇类和谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶双重功能［20］。Sfa1p的表达受到许多化学因素，例如甲醛、乙醇和甲磺酸甲酯等的影响［49］。当该酶氧化甲醛或丙酮醛时需要GSH和NAD，但是当氧化长链醇时却不需要GSH，并且其活性随链的长度而改变［49］。当SFA基因缺失时，菌株对甲醛的新陈代谢活性会降低［49］。

4 展望

β-苯乙醇应用非常广泛。近年来，由于人们对于天然产物的需求，加之生物转化法有成本低、无污染、周期短等优势，通过生物转化合成β-苯乙醇越来越受到人们的关注。目前，我们仍需深入研究β-苯乙醇代谢过程中关键酶及其编码基因的调控方式，通过改良菌株的遗传背景，并优化其发酵条件，进一步提高β-苯乙醇的产量。

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