透明质酸降解工艺条件优化*

王鑫，郭瑞琳，王派丽，孟颖，魏静，许丹丹，宋天雪

(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨，150076)

透明质酸又称玻璃酸(hyaluronic acid，HA)，是一种天然的具有保水功能的酸性黏多糖［1］。广泛存在于动物和人体的组织细胞间质(基质)和某些细菌的荚膜中，具有保持皮肤弹性的功能，能够锁住大量水分子，对皮肤组织具有保湿润滑的作用［2］。HA分子构造为一线性、并无分支的高分子。分子质量能够达到100～150万。低分子质量HA具有促进血管生成的活性，保护人体内肉芽组织免受氧自由基的破坏，并且能够促进伤口愈合［3-4］。高分子质量HA可以抑制巨噬细胞的吞噬能力，而低分子质量HA可促使巨噬细胞表达一些与炎症有关的因子［5］。低分子质量HA能渗透到真皮层，调节皮肤代谢，促进血液循环，有保健、美白作用，低分子质量HA几乎与用于任何种类化妆品［6］。因此，研究高效的降解出低分子质量的HA，使得HA的吸收利用率增加，既含有低分子HA的特性，也能达到高分子HA的作用效果，才更有助于其特殊作用的发挥［7］。本文采用化学法对纯化后的HA进行降解研究，并应用响应面法对降解条件进行优化，以提高产品的利用度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器或材料与设备

新鲜鸡冠市售;HA标品，上海源叶生物科技有限公司;CTAB，北京中生瑞泰科技有限公司;三氯甲烷，天津市天新精细化工开发中心;正丁醇，天津市福晨化学试剂厂;NaCl，天津市北方医化学试剂厂;葡萄糖，天津市进丰化工有限公司;铁氰化钾，天津市北辰方正试剂厂;VC，天津市津北精细化工有限公司;H2O2，天津市化工消毒用品有限公司;NaCO3，天津市晶科化工有限公司;无水乙醇，天津市天力化学试剂有限公司。

微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;R-205旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司;恒温水浴锅，余姚市东方电气仪器厂;SHZ-Dバ循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司;TU-1900型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;ALC-1100.2型电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;便携数显电子PH计测试笔，北京市立精化学器具有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HA标准曲线的绘制

准确称取0.025 0 g标准HA于25 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成标准溶液。分别量取HA标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，定容至刻度。以蒸馏水作为空白，在波长为198 nm处测定吸光度。以HA浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 HA提取工艺

将新鲜的公鸡冠用无水乙醇浸泡24 h至鸡冠变硬为止，将鸡冠干燥后粉碎。加入鸡冠粉末6～7倍蒸馏水，搅拌均匀，静置浸泡12 h，收集滤液，滤渣再按同样方法浸泡2次，合并滤液。将滤液不断搅拌，每100 mL滤液加入10 g的固体NaCl，完全溶解后，加入与滤液等体积的三氯甲烷、正丁醇溶液(三氯甲烷∶正丁醇体积比为4∶1)，连续搅拌2 h左右，采用分液漏斗静置分层取上层水相待用。取上述待用水相于烧杯中用体积分数90%乙醇浸泡，按照1∶2的比例将二者混合静置沉淀24 h，回收乙醇溶液，沉淀物干燥得HA粗品。

1.2.3 HA纯化方法

HA粗提物溶于0.15 mol/L NaCl中得到0.25%的HA溶液。1倍体积10%CTAB(溶在0.15 mol/L NaCl中)加入4倍体积的0.25%的HA溶液中。调节 pH=9.0，静置 4h。CTAB与 HA生成CTAB-HA复合物沉淀，离心分离。CTAB-HA复合物浸泡在1.5 mol/L NaCl溶液中，置于60℃水浴中静置2 h。CTAB-HA复合物可解离溶解。最终得到较纯的HA液体，干燥后待用。纯化后HA含量计算公式:

式中:W，HA 含量，%;m，HA 质量，g;M，纯化后物质量，g。

1.2.4 糖还原法测定产物的相对分子质量

以0.3 mol/L的Na2CO3溶液为溶剂，配制浓度为0.75 mg/mL的铁氰化钾溶液。采用分析纯葡萄糖配制浓度为1 mg/mL的溶液，并作5个梯度稀释。取各稀释液2 mL，与2 mL上述铁氰化钾溶液于比色管中混合均匀后在沸水浴上反应15 min，冷却，在420 nm波长下测吸光度。以吸光值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。HA的降解产物的相对分子质量的计算公式:

式中:α，降解产物浓度，mg/mL;β，葡萄糖浓度，mg/mL。

1.2.5 降解HA单因素条件的选择

1.2.5.1 H2O2和VC最佳比例的确定

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH调节pH至4.0，分别加入2、3、4、5、6、0.1 mol/L 的 H2O2溶液，反应开始，维持pH在4.0，反应15 min。分别取各烧杯中反应液2 mL，与2 mL铁氰化钾-碳酸钠溶液于比色管中混合均匀，在沸水浴上反应15 min冷却。在420 nm波长下测吸光度，根据糖标准曲线方程计算分子质量。

1.2.5.2 pH值对降解的影响

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的 VC，用 NaOH 调节 pH 值在4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，再加入4 mL 0.1 mol/L 的 H2O2溶液，反应开始，维持pH恒定，反应15 min，之后方法同1.2.5.1。

1.2.5.3 降解时间对HA降解的影响

量取5份HA粗品溶液每份5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH调节pH值至8.0，再加入4 mL 0.1 mol/L的H2O2溶液，反应开始，维持pH值恒定，反应 5、10、15、20、25 min，之后方法同1.2.5.1。

1.2.5.4 H2O2浓度对降解的影响

量取5份HA粗品溶液各5 mL，加入1 mL 0.1 mol/L的VC，用NaOH调节pH值至8.0，分别加入4 mL 1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mol/L 的 H2O2溶液，反应开始，维持pH值在8.0，反应5 min，之后方法同1.2.5.1。

采用Box-Behnken模型，以提取时间、料液比和乙醇浓度为影响透明质酸为主要的考察因子(自变量)，分别以 X1、X2、X3表示，并以 +1、0、-1 分别代表自变量的高、中、低水平，按方程X1=Xi-X0/X对自变量进行编码［8］。其中Xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，Xo为试验中心点处自变量的真实值，X为自变量的变化步长［9］，因子编码及水平见表1。并采用多元回归分析，拟合二次多项式回归模型的Box-Behnken设计试验，进行结果分析。在模型拟合出的最优条件下进行3次重复实验，以验证响应曲面拟合结果的可靠性。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平及编码Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 结果与讨论

2.1 HA标准曲线绘制结果

在198 nm下测得HA标准曲线，如图1，吸光度与浓度之间的回归方程为:y=7.805 0x+0.080 8(R2=0.998 3)，回归方程线性显著，该方程的有效线性范围为0～0.25 mg/mL。

图1 HA标准曲线Fig.1 HA standard curve

2.2 HA纯化结果与分析

由表2可知，提取后HA的含量为58.45%，纯化后HA的含量为82.58%，提高了24.13%，纯化后HA的分子质量为22671.88。

表2 HA提取纯化结果表Tables 2 The extraction and purification results of HA

2.3 葡萄糖标准曲线绘制结果

在420 nm下测得葡萄糖标准曲线，如图2，吸光度与浓度之间的回归方程为:y=0.013 3x-0.002 2(R2=0.992 6)，回归方程线性显著，该方程的有效线性范围为0～10mg/mL。采用糖还原法测定产物的相对分子质量，降解前 HA相对分子质量为22 671.88。

图2 葡萄糖标准曲线Fig.2 Glucose standard curve

2.4 降解HA单因素的选择结果分析

2.4.1 料液比单因素的选择结果分析

由图3可知，随着比例的增加，产物的吸光度值达到最低点后有所回升，最后趋于平行，当H2O2和VC添加量不一样时，反应产生的自由基的量也会不同。H2O2和VC对降解都有一定影响，但经实验验证，当和VC添加量比H2O2多时得到的吸光度值低于H2O2比VC多时的吸光度值，因此，VC对降解影响不显著，而H2O2的量对降解的影响相对较大。因此，单因素试验确定出最佳降解的料液比为4∶1。

图3 料液比对HA降解的影响Fig.3 Influence of ratio of Solid-liquid on the degradation of HA

2.4.2 pH值单因素的选择结果分析

以上研究结果多通过顶板结构计算顶板来压时的顶板压力，从而确定支架合理工作阻力，但其计算过程复杂，需要参数众多，具体实践过程中，很多参数难以精确取得。笔者以酸刺沟煤矿6上105-2综放工作面压架事故为背景，通过现场实测和理论分析，对压架机理进行研究，同时对工作面实测矿压数据进行分析处理，基于位态方程，从顶板控制效果出发，研究确定支架的合理工作阻力。

由图4可知，随着pH值的改变，透明质酸降解程度不同，原因是pH会影响羟基自由基的产生，羟基自由基对HA的降解密切相关，在pH 8.0时HA降解程度达到最好。因此，由单因素试验可确定最佳降解pH值为8.0。

图4 pH值对HA降解的影响Fig.4 Influence of pH on the degradation of HA

2.4.3 降解时间单因素的选择结果分析

降解HA主要是靠降解体系内自由基的作用，虽然自由基的作用很强但寿命极短。所以在反应初期分子质量下降很快，随后逐渐趋于下降并趋于稳定。由图5可知，时间越长HA降解的程度降低。在时间5 min时HA降解程度达到最好，若继续延长时间，HA降解的分子质量呈上升趋势。是因为降解时间过长可能使HA成分生物活性受到破坏，有效成分不再被降解，导致实验误差增大。因此，降解时间确定为5min。

图5 降解时间对HA降解的影响Fig.5 Influence of time on the degradation of HA

2.4.4 H2O2浓度单因素的选择结果分析

H2O2的浓度对降解的影响很大，研究中自由基的量通过H2O2的量来表示，当底物浓度一定时，随着自由基量的增加，分子量下降，当下降到一定程度后，分量下降十分缓慢了。由图6可知，随着H2O2的浓度的改变，HA降解程度不同，在H2O2浓度为1.6 mol/L时HA降解程度达到最好。因此，确定最佳降解1.6 mol/L。

图6 H2O2浓度对HA降解的影响Fig.6 Influence of H2O2concentration on the degradation of HA

2.5 响应曲面法优化HA的降解条件结果分析

2.5.1 多元回归分析设计及试验结果分析

采用多元回归分析，拟合二次多项式回归模型的Box-Behnken设计及试验结果见表3。利用 Design Expert软件对表3数据进行多元回归拟合，获得化学法降解鸡冠中提取的HA对降解料液比(x1)、H2O2浓度(x2)和pH(x3)的二次多项回归模型方程为:

Y=2 017.2-460.87x2-806.00x2-177.88x3-108.55x1x2-20.25x1x3-84.5x2x3+1 955.27X12+1 189.02X22+1 345.28X32

其中:Y，相对分子质量;x1，料液比;x2，H2O2浓度mol/L;x3，pH。

从方程的方差分析表4可见，试验所选用的模型高度显著(P＜0.000 1)，模型的校正决定系数0.978 4，说明该模型能解释97.84%响应值的变化，仅有总变异大约2.16%不能用此模型来解释;相关系数R=0.990 6，说明该模型拟合程度良好，试验误差小，该模型是合适的，可以用此来分析化学降解法对HA的降解程度。从表5的回归方程系数显著性检验可知，模型一次项x1显著、x2极显著、x3不显著;二次项x12(P ＜0.000 1)、x22(P ＜0.000 1)、x32(P＜0.000 1)极显著;交互项 x1x2，x2x3、x1x3不显著。

表3 实验设计与结果Table 3 Experimental design and results

表4 响应面模型方差分析表Table 4 Response surface model analysis of variance table

表5 回归方程系数显著性检验Table 5 Significance test of the regression equation coefficients

2.5.2 多元回归方程的响应曲面及其等高线图解结果与分析

由图7可知，料液比和H2O2浓度对降解HA的交互影响效应。从其响应曲面图可以直观的看出两因素的交互作用不显著，随着料液比的增大，HA的降解程度逐渐提高，料液比和H2O2浓度均对降解均有影响，H2O2浓度高比例大降解程度最好，分子量最低点为料液比为4.13∶1，H2O2浓度为1.67 mol/L。

图7 料液比、H2O2浓度及其交互作用对降解HA的响应曲面图Fig.7 Influence of liquid ratio，H2O2 concentration and their interactions on the response surface of the degradation of HA

由图8可知，降解pH和料液比对降解鸡冠中透明质酸的交互影响效应。从其响应曲面图可以看出两因素的交互作用不显著，在实验水平范围内，pH值对透明质酸降解影响不明显，相比料液比的作用更强，两因素交互作用最低点为pH值为8.16，料液比为4.13∶1。

图8 料液比、pH值及其交互作用对降解HA的响应曲面Fig.8 Influence of liquid ratio，pH and their Interactions on the response surface of the degradation of HA

由图9可知，pH与H2O2浓度对降解HA的交互影响效应。从其响应曲面图可以直观的看出两因素的交互作用不显著，在试验水平范围内，H2O2浓度对HA的降解影响大，pH影响程度较小，两项交互作用条件pH为8.16，H2O2浓度为1.67 mol/L时分子量达到最低点。

图9 H2O2浓度、pH值及其交互作用对降解HA的响应曲面Fig.9 Influence of H2O2concentration，pH and their Interactions on the response surface of the degradation of HA

2.5.3 验证试验结果与分析

通过单因素及响应曲面的分析，确定出降解HA最佳工艺条件。料液比为4.13∶1，pH为8.16，，降解时间为5 min;H2O2浓度为1.67 mol/L。根据确定的最佳降解条件进行验证试验，其结果见表6。

表6 验证试验结果表Table 6 The results of Verification test

采用优化后的工艺降解HA，得出该工艺降解透明质酸的分子量为1 764.67。

3 结论

从新鲜鸡冠中提取的粗提物中HA含量为58.45%，经纯化后 HA的含量为82.12%，提高了24.13%，经提取纯化后得到的HA的相对分子质量为2 2671.88，通过响应曲面法对HA的降解条件进行优化，最佳条件为:料液比为4.13∶1，pH 8.16，H2O2浓度为1.67 mol/L。采用优化后的条件降解HA，得出最佳降解条件下降解HA的分质子量为1 764.67。

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