顺铂作用下卵巢癌细胞株CP70中Eps8表达变化研究＊

第四军医大学西京医院妇产科（西安710032） 王 冰 杨 勇 辛晓燕

表皮生长因子受体通路底物8（Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，Eps8）为广泛表达的多域信号转导蛋白，调节着细胞两种完全不同的GTP依赖型生物机制：通过Ras／Rac通路影响肌动蛋白骨架的重组，以及通过Rab通路影响受体介导的细胞内吞作用［1］。近年来，许多学者［2，3］应用 RT－PCR（实时荧光PCR技术）、Western blot（蛋白质印迹法）、微阵列技术、基因敲除技术等实验方法发现，Eps8在乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、恶性血液系统疾病等实体肿瘤中表达异常升高，而在正常组织中未见表达或者表达较低。继而通过分子生物实验发现Eps8通过调节细胞肌动蛋白骨架影响肿瘤细胞的转移和侵袭，通过调节胞质中的溶酶体对肿瘤细胞的自噬作用，影响肿瘤的转移。但有关Eps8在卵巢癌方面的研究，国内外报道较少。本实验通过 RT－PCR、Western blot方法检测卵巢癌顺铂敏感细胞株A2780、耐药细胞株CP70、卵巢癌细胞株SKOV3、顺铂耐药株SKOV3／DDP中Eps8在mRNA及蛋白水平的表达情况，发现Eps8在顺铂耐药细胞株CP70中高表达，采用不同浓度DDP（顺铂）处理CP70细胞后检查Eps8蛋白表达变化情况，探讨该蛋白表达的变化与DDP作用于CP70发生耐药之间的关系，以期为卵巢癌治疗提供新的思路。

材料和方法

1 细胞株和主要试剂 A2780、CP70、SKOV3、SKOV3／DDP细胞株由第四军医大学西京医院妇产科实验室长期冻存留种。DDP为山东齐鲁制药厂产品，DMEM／低糖、1640培养基、FBS（胎牛血清）、Penicillin－Streptomycin、胰酶均为 Hyclone产品，逆转录酶（北京天根生物技术有限公司），Real－time PCR试剂盒（南京百斯凯科技有限公司，全式金cat：AQ131－01），TRIZOL（南京百斯凯科技有限公司，全式金cat：ET111－01，lot：H10318），氯仿、异丙醇 （分析纯），RNA溶解液（南京百斯凯科技有限公司，全式金cat：ET111－02，lot：H10323），DEPC（北京博奥拓达科技有限公司 Amresco cat：E174），引物合成（上海生工）：hEPS8F5’－GATGTCATTGGGAGGAACTTG－3’，hEPS8R5’－ATAAAGTTCAGCATTGGGGG－3’，hActin F 5’－GATGAGATTGGCATGGCTTT－3’，hActin R 5’－GTCACCTTCACCGTTCCAGT－3’。PMSF（南京沃宏Amresco，cat：329－98－6），cocktail（上海源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司 cat：26305－03－3，lot：10557），PBS（pH7．0），脱 脂 奶 粉 （伊 利 cat：66196131T），兔抗人Eps8单克隆抗体（美国Abcam公司），actin（杭州华安生物cat：1854－s），羊抗鼠二抗（南京伯利德生物cat：Abmart M21001L），羊抗兔二抗（上海华安生物cat：HA1001）。

2 方 法

2．1 A2780CP70SKOV3SKOV3／DDP四株卵巢癌细胞中EPS8的mRNA表达水平的检测：收集细胞，PBS离心洗涤2次，弃上清。往细胞沉淀中加入1ml的 Trizol，提取 A2780、CP70、SKOV3、SKOV3／DDP细胞总RNA。取总RNA 1μl进行反转录反应。反应条件为：70℃5min，冰上冷却2min，42℃50min，95℃5min，将反转录产物置－20℃保存备用。取cDNA 2μl作为模板，建立25μl反应体系，反应条件为：95℃3min，95℃30s，55℃20s，72℃20s，共进行40个循环，72℃延伸10min，最后一步溶解曲线反应条件：95℃15s，60℃15s，20min升温，95℃15s。采用RQ＝2－△△CT进行计算相对表达量，以内参基因actin为标准。CT值指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。数据分析用的是EXCEL，作图用的是Graphpad prism 5软件，主要是利用t检测是否有显著性差异。

2．2 Western blot：检测卵巢癌细胞株中 EPS8的蛋白表达水平：取对数生长期的细胞，去除培养液，4℃预冷的PBS清洗2次，加入蛋白裂解液100μl，冰上裂解30min，于4℃下12000rpm离心15min后，吸取上清液，BAC法测定蛋白浓度，将离心后的上清加入loading buffer，100℃5min，然后放于－80℃保存。将蛋白样品与SDS蛋白上样缓冲液混合后于100℃处理5min，每孔上样100μg细胞总蛋白，电泳时浓缩胶电压为70V；当溴酚蓝品进入浓缩胶时，电压为110V；待溴酚蓝到达胶底部后，将蛋白电转至PVDF膜，丽春红染色，封闭液室温封闭1h后，加入适量的一抗，4℃孵育过夜。以内参基因actin为标准，TBST清洗后，加入相应二抗室温孵育1h，TBST洗膜后，用ECL Reagent显色，应用Alpha Innotech系统对PVDF膜进行扫描及图像分析。

2．3 DDP处理后 Western blot检测卵巢癌细胞CP70中Eps8的蛋白表达水平：CP70细胞种于6孔板内，加入不同浓度（0μM、10μM、20μM、40μM）DDP并于24h和48h后收集细胞。实验步骤同上。

2．4 统计学方法：以SPSS17．0统计分析软件进行统计学处理。数据以均数±标准差（mean±SD）表示。P＜0．05为具有统计学差异，P＜0．01为具有统计学显著差异。

结 果

1 实时荧光定量PCR结果 在4株卵巢癌细胞中，Eps8在顺铂耐药细胞株CP70中的mRNA表达最高，而在顺铂敏感株A2780中mRNA的表达最低：耐药株CP70中Eps8mRNA是敏感株A2780的117倍，差异有统计学意义（图1）。

图1 实时荧光定量PCR－数据分析

2 Western blot结果 在内参蛋白表达一致的情况下，卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70中Eps8蛋白表达明显高于其他三种细胞株（图2）。

图2 WB检测EPS8蛋白表达变化

3 顺铂处理后Eps8的表达变化 实验以Eps8高表达的卵巢癌顺铂耐药细胞株CP70为研究对象，采用不同浓度（10μM、20μM、40μM）的顺铂处理细胞24h、48h，以不加顺铂为空白对照组（Control）。Western blot结果表明，随着顺铂浓度的逐渐增加，Eps8的蛋白水平表达增高，随着顺铂作用时间的延长，Eps8的蛋白表达呈现明显增强趋势（图3～4）。

图3 DDP处理24h后EPS8蛋白表达水平

图4 DDP处理48h后EPS8蛋白表达水平

讨 论

Eps8作为接受器型的酪氨酸激酶受体（RTKS），受表皮生长因子受体（EGFR）以及其他RTKS磷酸化而激活。Eps8与EGFR结合后，细胞的DNA合成和癌化能力增加［4］。Eps8也是一个肌动蛋白骨架。Maria等［5］在多形胶质细胞瘤（GBM）的三种不同细胞株中进行2D和3D实验，发现通过损伤细胞骨架的突出结构，可以达到抑制肿瘤侵袭的作用。而通过siRNA沉默Eps8，可以消除肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。研究证实，Eps8可以调节表皮生长因子EGF依赖的小G蛋白Rac的活性，进而调控细胞骨架肌动蛋白的构建和重排［6］。Eps8还调节Rab5的活性，参与受体介导的细胞内吞作用，影响Ras和Rac之间的信号转导［7］。此外，Eps8还参与多种肿瘤细胞的增殖和转移，增强促有丝分裂信号的释放，导致肿瘤细胞的恶变［8］。Thilo Welsch等［9］发现内源性 Eps8在转移性胰腺癌细胞株AsPC－1和Capan－1中定位于大泡溶酶体中，并且高表达。Eps8的异位表达增加了溶酶体的大小。结构功能分析显示，调节溶酶体改变的区域位于Eps8的氨基酸184～535片断。值得注意的是，此片断包含2个类似分子伴侣介导的细胞自噬作用所需要的KFERQ序列。此外，Eps8与Hsc70和LAMP－2的共同免疫沉淀反应物是细胞自噬作用下降的关键因素。这些研究说明，在人类的一些肿瘤细胞中，Eps8通过定位于溶酶体，进而调节细胞的自噬作用，促进了癌症肿瘤细胞的转移。Yao等［10］应用基因表达序列分析技术和cDNA阵列比较基因组杂交技术对乳腺癌细胞进行分析，结果发现，Eps8是一个肿瘤相关蛋白。有文献报道，光辉霉素（Mithramycin）通过抑制Src的表达，从mRNA水平及蛋白水平减少了Eps8的表达，从而降低了人类上皮癌细胞的增殖和迁移能力［10］。Gan［11］等应用蒽环类抗肿瘤药物 DNR（柔红霉素）作用于急性髓系白血病细胞株KGla，结果发现，DNR对KGla细胞的增殖有明显抑制作用，Eps8的mRNA及蛋白表达均呈下降趋势，因此推测DNR对于KGla细胞的杀伤抑制作用的机制之一可能是降低Eps8的表达。DDP是铂类化疗药物中最早被合成出来的，与光辉霉素、DNR同属于细胞周期非特异性药物，其作用机理主要是顺铂与DNA单链内两点或双链发生交叉联结，抑制癌细胞的DNA复制过程，导致细胞凋亡［12］。本实验应用 RT－PCR、Western blot技术从mRNA水平和蛋白水平检测Eps8在卵巢癌细胞株中的表达。结果发现，在4株卵巢癌细胞中，耐药细胞株CP70中Eps8mRNA和蛋白表达最高，而和它配对的顺铂敏感细胞株A2780中Eps8mRNA和蛋白也有表达，相对较低。同样的趋势出现在SKOV3和SKOV3／DDP这对细胞中。为了进一步明确Eps8与卵巢癌顺铂耐药之间关系，实验设计了不同剂量、不同作用时间的顺铂作用于高表达Eps8的顺铂耐药细胞株CP70，结果发现，顺铂处理CP70细胞后，Eps8的蛋白表达量增高，且和DDP作用的时间及剂量有依赖性，即DDP可诱导CP70细胞中Eps8表达的上调。因此推测，Eps8可能在卵巢癌顺铂耐药形成机制中发挥重要作用。

综上所述，Eps8的表达情况一定程度上反应了卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性，这就为我们研究卵巢癌顺铂化疗耐药提供了一条新思路，Eps8是否可以成为一个新型肿瘤化疗耐药的临床检测指标，为临床化疗方案的选择及评价预后提供有效依据？本研究为进一步探索Eps8在卵巢癌化疗耐药中的作用提供了实验依据，也为卵巢癌的基因治疗提供新的思路。

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