基因扩增联合测序法对痰标本分离的60株真菌病原学鉴定＊

陕西省人民医院检验科（西安710068）

胡淑玲 安 娜△ 刘先宁△▲ 张利侠 王亚妮△ 朱娟莉△ 朱秀萍△

随着广谱抗生素、激素和免疫抑制剂等药物的广泛应用，以及肿瘤患者、老年病人抵抗力的下降，使得深部真菌感染的机会愈来愈多。肺部感染居深部真菌感染的首位，如不及时诊治，病死率极高。快速、准确的诊断是治疗和抢救的关键。PCR技术的发展，使痰标本中真菌种属的快速鉴定得以实现。采用内转录间隔区（Internal transcribed spacer region，ITS）序列分析已用于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析［1］。本文采用已建立的PCR扩增ITS2区联合基因序列比对方法［2］，对痰标本分离的60株真菌和2种标准真菌株进行种属鉴定，现报告如下。

材料与方法

1 材料来源 收集2012年2月至9月，在陕西省人民医院就诊，检验科细菌室进行痰标本分离培养、涂片后显微镜检确诊为真菌的菌落标本60份。本组病例中，男51例，女9例，平均年龄（72．5±0．5岁）。病人来自呼吸科、老年病肿瘤科、老年病呼吸科、神经内科、干部病房科、血液病科等。标准真菌菌株：烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus），白色念珠菌（Candida albicans）均购于陕西省微生物研究所菌种保藏中心。

2 试剂与仪器 真菌基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit购于德国 Qiagen公司；2×Taq plus PCR Master Mix购于北京天根生化科技有限公司；DNA Marker购于大连Ta Ka Ra生物工程有限公司；引物合成和PCR产物测序由上海生工生物工程有限公司完成；Mastercycler gradient PCR仪购于德国Eppendorf公司；电泳仪和紫外分析仪购于北京六一仪器厂。

3 检测方法

3．1 真菌 DNA 提取：参见文献［3，4］，分别取标准菌株菌落及痰标本分离的真菌菌落约10mg置于5ml离心管中，加液氮研磨成粉状，然后按照DNeasy Plant Mini Kit试剂盒说明书的提取步骤提取真菌基因组DNA，得到10～50ng／μl的DNA溶液。

3．2 PCR扩增ITS2区：PCR扩增引物采用通用引物序列，引物ITS1的序列（5′～3′）为 TCCGTAGGTGAACCTGCGG，其长度为19bp，引物ITS4的序列（5′～3′）为 TCCTCCGCTTATTGATATGC，其长度为20bp。PCR反应体系：总体积30μl，其中模板为提取的真菌DNA 2μl（阴性对照用等体积的无菌去离子水），引物ITS1，ITS4 各 1μl，2×Taq plus PCR Master Mix 15μl，无菌去离子水11μl；反应程序95℃预变性5min后，95℃30s，55℃ 1min，72℃1 min共计35个循环，72℃延伸6min，-20℃保存备用。扩增产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。

3．3 序列比对与种属分析：测序结果采用美国国立生物 信 息 中 心 （National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST工具，基因库中真菌核酸序列比对，确定其种属并进一步进行分析。

结 果

1 PCR扩增ITS2区的检验结果 琼脂糖凝胶电泳显示，2种标准菌株以及痰标本分离的真菌菌株在500bp左右有扩增条带。

2 PCR产物测序及真菌种属鉴定结果 PCR反应产物经琼脂糖凝胶鉴定后测序，测序结果使用NCBI网站的BLAST工具，并与基因库中的真菌核酸序列比对，鉴定真菌种属。2种标准菌的PCR产物序列经比对与基因库中一致。60株痰标本分离的真菌株与基因库中的真菌核酸序列比对后，曲霉菌属24株，青霉菌属4株，念珠菌属29株，其它丝状菌还有暗孢节菱孢菌2株，淡紫拟青霉菌1株和串珠状赤霉菌1株。结果见附表。

附表 60株痰标本分离的真菌株种属及构成比

讨 论

近年来，深部真菌感染的发病率不断上升。2004年的调查结果表明，真菌感染率为20世纪90年代的2．4倍，2003年北京协和医院统计的侵袭性真菌感染发生率是20世纪90年代的3．6倍 ，且以念珠菌属和曲霉菌属为主［5，6］。

本研究采用基因测序法对痰标本分离的60例真菌进行种属分析，其中念珠菌菌属占48%，曲霉菌属占40%，青霉菌占5%，其它丝状菌占7%，与上述研究结果一致。另外还检测到了暗孢节菱孢菌（3%）、串珠状赤霉菌（2%）等罕见报道的真菌。

致病性真菌的鉴定对深部真菌感染的诊治具有重要意义，目前临床上仍以表型鉴定为主，但该方法专业技术要求较高，耗时长，且对某些致病菌种往往不能准确鉴定［7］。而以基因序列为鉴定基础的分子生物学方法对具有种间差异性和种内保守性的目标区域进行PCR扩增，随后进行序列测定，并在数据库中比对得到鉴定结果，这种测序的方法由于客观、可重复性好等优点，目前在病原真菌的鉴定中常被认为是分子鉴定的 “金标准”［8］。

基因测序法能快速、简便、准确地鉴别痰培养的真菌种属，为本地区呼吸道真菌性疾病病原菌流行病学调查及个性化治疗奠定基础。

［1］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequencebased identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here？［J］．J Clin Microbiol，2009，47（4）：877-84．

［2］ 刘先宁，胡淑玲，安 娜，等．半巢氏PCR扩增联合基因测序鉴定丝状真菌的实验研究［J］．现代检验医学杂志，2014，28（50）：48-52．

［3］ 安 娜，王亚妮，刘先宁，等．真菌性角膜炎致病菌种属的PCR鉴定［J］．眼科新进展，2010，30（11）：1017-1020．

［4］ 杨潇远，李振勇，屈超义．角膜炎常见致病真菌DNA快速提取方法的探索［J］．中华检验医学杂志，2005，（9）：86．

［5］ 马 军．侵袭性真菌感染的流行病学［J］．中华医学杂志，2005，85（21）：1443-1444．

［6］ 刘正印，盛瑞媛，李旭丽，等．院内真菌感染149例分析［J］．中华医学杂志，2003，83（5）：399-402．

［7］ Cuenca Estrella M，Bernal-Martinez L，Buitrago MJ，etal．Update on the epidemiology and diagnosis of invasive fungalinfection［J］．Int J Antimicrob Agents，2008，32Suppl 2：S143-147．

［8］ Balajee SA，Borman AM，Brandt ME，etal．Sequence based identification of Aspergillus，fusarium，and mucorales species in the clinical mycology laboratory：Where are we and where should we go from here7［J］．J Clin Microbiol，2009，47：877-884．